Action sur l'osmoregulation de l'anguille de divers antibiotiques inhibiteurs de la synthese des proteines ou du renouvellement cellulaire

Action sur l'osmoregulation de l'anguille de divers antibiotiques inhibiteurs de la synthese des proteines ou du renouvellement cellulaire

Comp. Biochem. Physiol., 1969, Vol. 30, pp. 1125 to 1151. Pergamon Press. Printed in Great Britain A C T I O N SUR L ' O S M O R E G U L A T I O N DE...

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Comp. Biochem. Physiol., 1969, Vol. 30, pp. 1125 to 1151. Pergamon Press. Printed in Great Britain

A C T I O N SUR L ' O S M O R E G U L A T I O N DE L ' A N G U I L L E DE DIVERS A N T I B I O T I Q U E S I N H I B I T E U R S DE LA S Y N T H E S E D E S P R O T E I N E S OU DU RENOUVELLEMENT CELLULAIRE

J. MAETZ, J. NIBELLE, M. BORNANCIN et R. MOTAIS Groupe de biologie marine. Departement de Biologie du C.E.A., Station Zoologique, Villefranche-sur-Mer (06), et Laboratoire de physiologie animale, Facult6 des Sciences de Nice (06), France (Received 22 January 1969)

A b s t r a c t - - 1 . Actinomycin D produces an impairment of the branchial osmoregulatory processes of the eel, important in sea water and only slight in fresh water. 2. Actinomycin D also perturbs the pattern of outflux readjustment during transfer from one medium to the other. 3. Puromycin and cycloheximide produce effects opposite to those resulting from actinomycin treatment. 4. Mitomycin and the aminonucleoside derivate of puromycin remain without effect. 5. The significance of these observations is discussed in terms of a model suggesting molecular renewal of an ionic transfer carrier and of a non-specific inhibitor of this carrier. INTRODUCTION DES OBSERVATIONS ant6rieures, mettant en oeuvre la technique des indicateurs nucl6aires ont mis en 6vidence la lenteur des 6changes de sodium chez les t616ost6ens vivant en eau douce et leur rapidit6 en eau de m e r (Mullins, 1950; Motais, 1961, 1967; Maetz, 1954; voir la revue de Ports, 1968). L a part de l'6pith61ium branchial dans ces 6changes semble pr6pond6rante. Chez les poissons euryhalins, toute variation de la salinit6 du milieu externe entraine des changements dans l'intensit6 des 6changes ioniques branchiaux. C o m m e l'ont montr6 Motais et al. (1966), ces modifications r6sultent chez le flet ou l'anguille de l'intervention de ph6nom~nes adaptatifs de deux types, Fun rapide et l'autre lent. L e m6canisme rapide est en rapport avec l'existence probable d ' u n transporteur de diffusion par 6change p e r m e t t a n t un couplage du flux entrant et du flux sortant. L e m6canisme lent correspondrait ~ une variation progressive de l'activit6 de ce t r a n s p o r t e u r sans modification de son affinit6 p o u r le sodium. Cependant, les analyses cin&iques de ces auteurs ne p e r m e t t e n t pas de pr6ciser si l'augmentation de l'activit6 du t r a n s p o r t e u r observ6e lors d ' u n e 616vation de la salinit6 du milieu externe est due ~ une synth~se de nouvelles mol6cules de transp o r t e u r ou ~ la destruction progressive d ' u n inhibiteur de type non sp6cifique de celui-ci. 38

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J. MAETZ, J. NIBELLE, M . BORNANCIN ET R. MOTAIS

Signalons qu'une 6tude immunochimique r6cente de la diff~renciation cellulaire de l'@itMlium branchial chez le saumon Oncorhynchus (Conte & Morita, 1968) sugg~re que l'adaptation aux milieux de salinit6 ~lev~e induit une synth~se de constituants cytoplasmiques prot6iniques. Dans le but d'analyser ces deux possibilit~s, nous avons cherchfi 5 v~rifier chez l'anguille si certains antibiotiques connus pour interf6rer avec la synth~se des prot~ines 6taient susceptibles de modifier les 6changes ioniques catalys6s par le transporteur de diffusion par 6change. En outre, diverses observations sugg~rent que l'activit6 de ce transporteur semble ~tre li6e plus ou moins directement celle de la pompe d'excr6tion de sel qui assure l'~quilibre de la balance min6rale en eau de mer (Motais, 1967; Mayer et al., 1967; Maetz & Skadhauge, 1968; Maetz, 1969). Par cons6quent toute alteration du m6canisme de diffusion par 6change obtenue par l'action des antibiotiques devrait en principe entra~ner une perturbation de l'osmor~gulation en eau de mer. Ce m6canisme est inop~rant dans la branchie du poisson en eau douce et donc [email protected] de la pompe d'absorption de sel qui assure l'~quilibre de la balance min&ale dans ce milieu. I1 ~tait donc int6ressant d'&udier ~galement les effets des antibiotiques sur l'osmor~gulation dans ce milieu ainsi qu'au cours des transferts eau douce-eau de mer. Trois antibiotiques ont fit6 choisis: l'actinomycine D, la cycloheximide et la puromycine. L'actinomycine D bloque la synth~se des prot6ines en agissant au milieu de la transcription par l'inhibition de la synth~se du mRNA dans le noyau. La cycloheximide et la puromycine agissent au niveau de la "translation" ou traduction ribosomale en bloquant le transfert de l'amino-acyl-s-RNA dans la prot6ine en voie de formation. Nous avons aussi injects l'aminonucl6oside de la puromycine afin de faire la part d'effets non sp~cifiques qui sont dfis 5 la d6composition de la puromycine en ce d6riv6 (voir les revues r~centes de Reich et al., 1967 ; Nathans, 1967; Sisler & Siegel, 1967). Mais ces antibiotiques sont aussi susceptibles d'inhiber la division cellulaire (voir Discussion). Or Conte & Lin (1967), comparant la cin6tique de la m o p phog~n~se cellulaire de l'@ith~lium branchial du saumon Oncorhynchus en eau douce et en eau de mer, ont observ6 que le taux de renouvellement cellulaire mesur6 par la vitesse d'incorporation de la thymidine triti~e dans le D N A est nettement plus rapide en eau de mer. De plus, les &udes autoradiographiques et biochimiques de ces auteurs sugg+rent que les cellules dont le renouvellement est acc616r6 en eau de mer sont les cellules @ith6liales riches en mitochondries, c'est-5-dire les "cellules 5 chlorures" de Keys & Willmer (1932) dont le r61e dans l'osmor6gulation fait l'objet de discussions (voir Philpott, 1965, ou Parry, 1966). Dans un travail ant6rieur Conte (1965) avait observ6 chez Oncorhynchus que les rayonnements ionisants produisent des changements histopathologiques dans les 6pith61iums ~ renouvellement cellulaire rapide (intestin et surtout branchie). Or des doses de rayonnement s'av6rant l&ales chez le saumon adapt6 5 l'eau de mer, restent sans effet chez le saumon vivant en eau douce. De plus, chez les animaux en eau de mer, de s~v+res perturbations de t'osmor6gulation sont observ6es et les concentrations plasmatiques de Na et C1 deviennent anormalement ~lev6es aprbs irradiation.

LES ANTIBIOTIQUF~ ET L'OSMORI~GULATION DE L'ANGUILLE

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P o u r r e c h e r c h e r c h e z l ' a n g u i l l e la p a r t d u b l o c a g e d u r e n o u v e l l e m e n t c e l l u l a i r e p a r les a n t i b i o t i q u e s s u s - m e n t i o n n 6 s dans l eu r s effets su r l ' o s m o r 6 g u l a t i o n , n o u s a v o n s 6 g a l e m e n t 6tudi6 F a c t i o n d ' u n a n t i b i o t i q u e m i t o l y t i q u e , la m i t o m y c i n e . C e t t e s u b s t a n c e p r o d u i t u n e i n h i b i t i o n d e la r e p l i c a t i o n d u D N A h cause des liaisons c o v a l e n t e s q u ' e l l e c o n t r a c t e avec cet t e m o l 6 c u l e (Szybalski & I y er , 1967). TECHNIQUES ET MATERIEL BIOLOGIQUE Animaux Nos recherches ont port~ sur une centaine d'anguilles jaunes Anguilla anguilla L. de poids corporel allant de 50 h 295 g, en moyenne 130 g. Ces animaux provenant de Camargue* et p~ch6s en eau douce ont ~t6 conserv6s dans ce milieu (concentration du sodium: 0,10,2 m-~quiv./1 ~ une temperature non contr61fie (8-18°C) ou adapt6s ~ l'eau de mer pendant au moins 1 semaine (14-18°C). Mesures de f l u x ioniques Toutes les mesures de flux ont 6t6 effectufies h 16-17°C, les animaux 6tant acclimates cette tempfirature depuis au moins 48 h. (1) E n eau douce. Les flux ont 6t~ mesur6s par la technique de Maetz (1956) consistant additionner du 2*Na au milieu externe et h suivre en fonction du temps l'~volution de la concentration du sodium total et du 24Na du milieu externe. Les flux entrant et net de sodium sont calcul6s directement ~ partir des courbes d'~volution de ces concentrations et le flux sortant est d6duit des flux entrant et du flux net. Comme l'urine des anguiUes en exp6rience n'a pas ~t~ recueillie, c'est le flux sortant global qui est d~terminC Les flux sont exprim6s en br~quiv./h et rapport6s h 100 g de poids corporel. (2) E n eau de mer. Le plus g~n~ralement c'est la vitesse de renouvellement du sodium interne qui a ~t~ mesur~e suivant une technique donnfie par Motais et al. (1966) ou Motais (1967). Le taux d'6change est dfiduit du d~cr~ment logarithmique de la courbe exponentielle d'apparition du 24Na dans le milieu externe. Le traceur est injectfi dans la cavit6 intrap6riton6ale du poisson au d~part et celui-ci est plae6 dans un aquarium en circuit ferm6 contenant un volume d'eau de met connu. La dur~e de l'exp6rience est de 6 h 8 h. Le taux est donn6 en pourcentage par heure. Dans certains cas, le flux sortant a 6t6 mesur6 directement apr~s d~termination du flux sortant radioactif horaire et de la radioactivit6 sp~cifique du sodium interne apr~s prise de sang dans l'art~re caudale. L'espace de distribution du sodium 6changeable a ~t~ admis 6gal /~ 30 pour cent du poids corporel dans tous les cas (voir Motais, 1967). Le flux est exprim6 en/z6quiv./h par 100 g. (3) Transferts eau de mer-eau douce et vice-versa. L'~volution des flux sortants au cours de ces transferts a fit~ suivie grfice h des techniques donn6es par Maetz et al. (1967) ou Motais (1967). Dans le cas du transfert eau douce-eau de mer, les flux sortants ont ~t~ mesurfis directement pendant 1 h e n eau douce, puis 10 h e n eau de mer. Le vitesse de renouvellement du sodium interne a ensuite 6t6 d6termin6e 24 h apr~s le transfert et le flux sortant est calcul6 h partir de ce taux, connaissant la masse de sodium renouvelable. Dans le cas du transfert inverse (eau de mer-eau douce) les flux ont fit6 suivis durant 1 h en eau de mer puis pendant les deux premi6res heures apr~s passage en eau douce. Ce type d'exp6rience avait pour but de tester d'une part l'importance du param~tre de diffusion par 6change responsable de la r6duction instantan6e du flux sortant que l'on observe apr&s passage en eau douce et d'autre part l'intensit6 de la rfgulation diff6r6e qui correspond ~ une rdduction progressive du flux sortant dans les heures suivantes.

* Nous remercions M. Coustellier qui nous a fourni les anguilles et le Service des transports du Centre d'Etudes Nucl6aires de Cadarache qui les a amen6s h Villefranche.

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J. MAETZ, J. NIBELLE, M. BORNANCIN ET R. MOTAIS

Injections d' antibiotiques Toutes les injections ont 6t6 effectu6es dans la cavit6 intrap6riton6ale. Le solvant des antibiotiques a 6t6 du chlorure de sodium en solution aqueuse h 0,8%. Le volume inject6 a 6t6 de l'ordre de 0,1 ml/100 g. Les doses, exprim6es par 100 g de poids corporel, ont 6t6 les suivantes: 1. Mitomycine C (Calbiochem, lot 64298 ou NBC 8952)--deux fois 100 ou 200/~g par jour pendant 4 jours. 2. Puromycine dihydrochloride (Sigma 77B/0090 ou NBC 4363)--750-1000/~g administr6 en une seule fois. 3. Puromycine aminonucl6oside (NBC 4479)--500/~g administr6 en une seule fois. 4. Cycloheximide (Acti-dione NBC 4172)--30/~g administr6 en une seule fois. 5. Actinomycine D (Rh6ne-Poulenc F M 863 5221 ou Merck Sharp Dohme, L 5546510-10) :--soit en doses fractionn6es de 10 ou 20/Lg administr6es toutes les 24 h jusqu'fi une dose totale de 40 ou 60/zg;--soit en dose unique de 50 ou de 60/zg. Le d6tail du protocole exp6rimental sera donn6 pour chaque type d'exp6rience. Les concentrations du sodium interne ou externe sont donn6es en m-6quiv./1 et mesur6es apr~s dilution appropri6e par photom6trie de flamme d'absorption. La concentration des chlorures a 6t6 mesur6e par potentiom6trie selon la technique de Sanderson (1952) ou par amp6rom6trie dans un appareil Aminco-Cotlove. RESULTATS

1. Action de l'actinomycine D (a) Poissons adaptds ~ l'eau de mer. D e u x g r o u p e s d e q u a t r e p o i s s o n s o n t 6t6 trait6s p a r l ' a c t i n o m y c i n e D . L e s p o i s s o n s d u p r e m i e r g r o u p e re~oivent 10/~g q u o t i d i e n n e m e n t j u s q u ' h u n e d o s e c u m u l a t i v e d e 60/zg. L e s p o i s s o n s d u d e u x i 6 m e g r o u p e r e q o i v e n t u n e d o s e u n i q u e d e 50/zg. L e s d6tails d u t r a i t e m e n t ainsi q u e les o b s e r v a t i o n s s o n t consign6s d a n s le T a b l e a u 1. TABLEAU 1--ACTION DE L'ACTINOMYCINE D SUR LES I~CHANGESDE SODIUM DE L'ANGUILLE EN EAU DE iVIER

Groupe 1. Doses fractionn6es de 10 k~g par jour donn6es 15 h avant les mesures h partir de J0* Temps en jours, moyenne +E.S. n

J-~o 29,6

J-is 29,0

J-s 29,2

Jo 29,0

J1 25,8

J2 21,2

n

J4 --

J5 5,5

Je 1,6~

1,38

2,12

2,53

3,79

1,53

4,45

2,55

1,94

0,58

4

4

4

4

4

4

4

4

3

Groupe 2. Dose unique de 50/zg administr~e 15 h a v a n t J t 3o J~ 3~ Temps en jours, moyenne +E.S.

J3 16,9

30,5

24,3

19,7

33

34

14,5

6,0++

2,20

3,72

7,85

8,10

1,89

4





3

3

* Fractions renouveMes en pour cent/h. Fraction calcuMe d'apr+s les mesures de flux sortant sur les 3 animaux survivants: 110/z~quiv./h par 100 g _+40. ++Fraction calcuMe d'apr~s les mesures de flux sortant sur 3 animaux: 370 + 117/~6quiv./ h par 100 g. § Un animal est mort entreffl e t J v

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LES ANTIBIOTIQU~ El" L'OSMOREGULATION DE L'ANGUILLE

Les animaux du premier groupe ont 6t6 &udi6s durant les 3 semaines qui pr6c~dent le traitement et l'on note que la vitesse de renouvellement reste relativement constante et voisine de 30 pour cent/h. On constate que l'actinomycine produit progressivement une diminution de la vitesse des 6changes qui est r6duite quelques pour cent, 5-6 jours apr~s le d6but du traitement. Un animal meurt au sixi~me jour et les trois autres poissons meurent au cours des 48-72 h suivantes. La mesure directe du flux sortant effectu6e le sixi~me jour confirme l'importante r6duction des 6changes 110 + 40 tz6quiv. (n = 3) contre 1309 + 119 (n = 6) chez les poissons intacts (voir Maetz et al., 1967, et Tableau 2). Des conclusions analogues se d6gagent des observations concernant le deuxi~me groupe. Toutes les anguilles meurent au cours des 3 jours suivant la fin du traitement. La Fig. 1 illustre les r6sultats obtenus. TABLEAU 2--EvoLUTION DU FLUX SORTANT DE SODIUM AU COURS DU PASSAGEEAU DE MER--EAU DOUCE A c t i o n de l ' a c t i n o m y c i n e

EM

ED1

EDz

T6rnoins (n = 6)

Flux moyen + E.S. Comparaison

1309 119 (100)

168 55 (13,9 +_4,1)

66 37 (5,5 + 3,0)

21 2,7 (1,5 _+0,3)

Trait6s (n = 4)

Flux moyen + E.S. Cornparaison

201 33 (100)

123 36 (57,0 +_10,1)

130 36 (63,1+_10,6)

111 32 (66,5+ 30,5)

F l u x e n / z 6 q u i v . / h par 100 g mesur6s d ' a b o r d p e n d a n t 1 h ou ½ h e n eau de rner puis 2 h cons6cutives e n eau d o u c e (ED1 et ED,). L a premi6re h e u r e en eau douce est 6tudi6e d e m i - h e u r e par d e m i - h e u r e . L a c o m p a r a i s o n est faite en p r e n a n t les flux observ6s en eau de m e r c o m m e base 100. A n i r n a u x trait6s: D e u x a n i m a u x d u g r o u p e 1 (ff~) et deux a n i m a u x d u g r o u p e 2 (if4) d u tableau pr6c6dant ont 6t6 utilis6s. Anirnaux t 6 m o i n s ; voir M a e t z et al. (1967).

A la r6duction importante des 6changes de sodium est associ6e une 616vation consid6rable de la concentration des 61ectrolytes du milieu int6rieur. Les six animaux survivants au quatri~me jour (du groupe 2) et au sixi~me jour (groupe 1) pr6sentent une chlor6mie et une natr6mie exceptionnellement 61ev6es avoisinant 210 ou 220m-6quiv./l contre environ 130 ou 145 m-6quiv, chez les poissons intacts en eau de mer (voir Tableau 5 et Fig. 2). I1 apparalt donc clairement que l'action 16tale de l'actinomycine chez l'anguille en eau de m e r e s t [email protected] d'une perturbation importante de l'osmor6gulation qui se traduit non seulement par une importante inhibition des 6changes d'61ectrolytes mais aussi par une 616vation anormale de leur concentration plasmatique.

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J. MAETZ, J. NIBELLE, M. BORNANCIN ET R. MOTAIS

g T.R.

Exp. 1

30 O ""'

C,'

0

._..~ Exp.2

!

t

1C

\ I

I

-20

[

I

I

I

I

I

-10

0

2

4

6

8

0 j

[

I.

0

2

I 4 j

FIG. 1. Effet de l'actinomycine D sur le taux de renouvellement du sodium par la branchie en fonction du temps (voir Tableau 1). T.R., taux de renouvellement en pourcentage de sodium ~changeable par heure. J, jours. Exp. 1: Ce groupe a regu des doses quotidiennes de 10/zg d'antibiotique apr~s que la vitesse de renouvellement ait 6t~ mesur6e quatre fois avant le traitement et trouv6e constante. Les mesures sont effectu~es 15 h apr~s injection. Exp. 2: Ce groupe a regu une dose unique de 50/zg aussit6t apr6s la mesure de flux t6moin. (b) Transfert eau de mer-eau douce. O n sait q u ' a u cours du passage eau de m e r - e a u d o u c e chez l'anguille (voir M a e t z et al., 1967) le flux sortant subit une r6duction instantan6e qui ram&ne ce flux ~t 15 p o u r cent de sa valeur initiale d~s la premi6re derni-heure suivant le traitement. Cette r6duction est due ~ u n m6canisme de diffusion par 6change c o r r e s p o n d a n t fi u n couplage des flux entrant et sortant (voir Motais, 1967). L e flux sortant subit ensuite une r6gulation diff6r6e qui p r o g r e s s i v e m e n t ram+ne le flux 5 u n niveau caract6ristique de celui que l'on observe en eau douce. A u cours de la seconde d e m i - h e u r e apr+s le transfert, par exemple, ce flux n ' e s t plus que de 5 p o u r cent du flux observ~ en eau de m e r et l ' h e u r e suivante il ne reste que 1,5 p o u r cent du flux initial (voir T a b l e a u 2 et M a e t z et al., 1967). D e u x poissons du g r o u p e 1 de la s6rie pr6c~dente (Ja) ainsi que deux poissons du g r o u p e 2 (J~) ont subi u n transfert d ' e a u de m e r en eau d o u c e afin de p e r m e t t r e l ' & u d e des effets de l'antibiotique sur l'6volution du flux sortant apr6s transfert en eau douce.

LES A N T I B I O T I Q U E S

ET L'OSMORI~GULATION DE L'ANGUILLE

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L e Tableau 2 et la Fig. 2 rapportent les observations recueillies. On constate d'abord que le flux sortant trouv6 en eau de m e r e s t tr~s r6duit si on le compare celui des animaux t6moins. Ceci confirme les conclusions rapportfes dans le paragraphe prfc6dent. Apr~s passage en eau douce on constate d'une part que le flux sortant des animaux trait6s subit une r6duction instantan6e tr~s limit6e (40

i~ Fs

C

EM

ED

1250

1000

75C

A I 500

I

EM I

ED

250 ~ ] i

i1 i -1

0

2 h -1

o

1

2

h

FIG. 2. Evolution des flux sortants en fonction du temps au cours de transfert eau de mer-eau douce: effet de l'actinomycine D (voir Tableau 2). Flux en /x6quiv./h par 100 g. Temps en heures. P6riodes en eau de mer (½ h ou 1 h), colonne hachur6e. P6riodes en eau douee (deux fois ½h, puis 1 h), colonnes blanches. C, animaux contrbles; A, animaux trait6s 5 l'actinomycine D. pour cent du flux initial). I1 apparait donc que le param~tre "diffusion par dchange" correspondant au couplage des flux entrant et sortant qui repr6sente plus de 1100/x6quiv./h par 100 g chez les animaux t6moins, reste inf~rieur fi 100/x6quiv. apr~s traitement fi l'actinomycine. D'autre part on constate que la r~gulation diff6r~e que traduit une diminution rapide du flux sortant chez les t~moins est pratiquement inexistante chez les poissons ayant re~u l'antibiotique (voir Tableau 2). (c) Poissons adapt¢s ~ l'eau douce. U n groupe de cinq poissons conserv6s en eau douce en aquarium individuels a re~u de l'actinomycine en doses fractionn6es 20/xg le premier jour et 10/xg les jours suivants. Le quatri+me jour les ~changes de sodium sont mesur~s en eau douce. U n second groupe de deux poissons a re?u 60/xg en dose unique administr~e 5 jours avant la mesure de flux. Les observations

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J. MAETZ, J. NIBELLE, M. BORNANCINET R. MOTAIS

TABLEAU 3 - - A C T I O N DE LSACTINOMYCINE SUR LES ECHANGES DE SODIUM DE L'ANGUILLE EN EAU DOUCE

Flux T6moins (n = 20) Trait6s (n = 7)

En/z~quiv./h par 100 g _ E.S. En/z6quiv./h par 100 g ± E.S.

.f~

fs

4,08 0,36 5,20 1,22

4,62 0,46 14,37" 3,78

fn -0,54 0,36 -9,17" 3,61

fe/Naext 34,6 2,42 37,7 6,95

* Diff6rence significative h P < 0,001. Cinq animaux ont regu 40/zg en doses fractionn6es, le traitement ayant commenc~ 4 jours avant les mesures. Deux animaux ont requ 60/zg en dose unique administr~e 5 jours avant les mesures de flux. L'augmentation des flux sortants sous l'action de l'actinomycine a 6t6 ~galement observ6 chez les animaux du tableau suivant. Cependant les flux de ces derniers sont nettement plus 61ev6s. Les animaux dont les r6sultats sont rapport6s ici sont des animaux non perturbfs alors que ceux du Tableau 4 ont subi un effet de choc (injection de l'isotope et raise en aquarium environ ½ h avant les mesures de flux). Le "choc" produit une augmentation importante du flux sortant en eau douce (voir Maetz, 1964).

F

C

A

15

~0

FIG. 3. La balance min6rale globale du sodium chez l'anguille en eau douce: effet de l'actinomycine D (Tableau 3). Flux entrant (e) ou flux sortant (s) en/~6quiv./ h par 100 g. C, animaux t6moins; A, animaux trait6s h l'actinomycine D. Crochets : erreur standard de la moyemae.

recueillies c o n c e r n a n t ces d e u x g r o u p e s 6taient tr~s c o m p a r a b l e s : elles o n t 6t6 r 6 u n i e s d a n s le T a b l e a u 3 et la Fig. 3 et compar6es ~ celles o b t e n u e s s u r v i n g t p o i s s o n s intacts. O n constate q u e chez les t 6 m o i n s la b a l a n c e d u s o d i u m est e n 6 q u i l i b r e alors q u e le b i l a n des 6changes est n 6 g a t i f chez les a n i m a u x trait6s. M a i s alors q u e le flux e n t r a n t et le r a p p o r t flux e n t r a n t / c o n c e n t r a t i o n d u s o d i u m e x t e r n e

TABLEAU 4----ACTION DE L'ACTINOMYCINE ET DE LA PUROMYCINE SUR LE RI~AJUSTEMENT DU FLUX SORTANT AU COURS DU TRANSFERT D'EAU DOUCE EN EAU DE MER

1. T6moins (n = 11) 2. Aetinomycine : 50/zg, 2 h avant transfert (2) 3. Actinomycine: 50/~g, 12 h avant transfert (2) 4. Actinomycine: 50/zg, 26-30 h avant transfert (n = 8) 5. Actinomycine: 60/zg, doses fractionn~es ou dose unique~ (n = 5) 6. Puromycine: 750/Lg, 2havanttransfert (n = 4)

El)

EM1 EM2 EM3 EM4 EM~ EMe

EM7

EMs

EM9

EMlo EM~,-3~*

Flux moyen +E.S. Flux moyen

21 4,4 13

73 103 177 282 392 494 19,9 33,7 51,1 62,0 77,7 95,8 73 185 320 465 550 620

486 79,2 590

542 83,2 600

584 83,5 640

590 80,2 725

Flux moyen

38

357

372

397

382

Flux moyen +E.S.

64[[ 13,6

146§ 42,2

156II 44,7

15911 46,0

17411 51,9

7,211 1,77

102§ 43,2

11911 48,3

128 II 50,9

138 II 54,4

9,1 [I 1,39

110 153 296 466 666 973++ 102011 1228[I 1520[I 35,5 22,6 143,4 132,8 132,8 249,0 121,5 141,8 236,1

1485 }1 184,9

195 93 11,4

240

85§ 38,1

275

300

315

91 121 117++ 135§ 133§ 11,4 17,6 28,3 31,9 38,0

Flux moyen 12011 152 133 +E.S. 38,2 47,9 36,8 Flux moyen +E.S.

197

97 23,6

94 104~ 128++ 29,7 36,0 45,3

28,0 2,64 24,0

O

--

--

Les flux ont 6t6 mesur6s pendant 1 h en eau douce, puis 10 h consdcutives en eau de mer (en/zdquiv./h par 100 g). * La vitesse de renouvellement du sodium a ~t~ mesur6e 24-32 h apr~s le transfert pour un certain nombre de s~ries (en pourcent du Na ~changeable ~ l'heure). t Le traitement par l'antibiotique a commenc6 4-5 jours avant le transfert en eau de mer. Comparaison statistique entre les t6moins et les diff6rents groupes: ++P < 0,05; § P < 0,02; [1P < 0,01.

O

0

c

1134

J.

MAETZ, J. NIBELLE, ~'1. BORNANCIN ET R. ~IOTAIS

(fe/Naext) n ' e s t pas modifi6 p a r le traitement, on assiste ~ une a u g m e n t a t i o n du flux sortant trbs significative. Les pertes de sodium, de l ' o r d r e de quelques p o u r cent de la masse de s o d i u m & h a n g e a b l e , p r o d u i s e n t un abaissement de la c o n c e n tration des 61ectrolytes ( s o d i u m et chlore) qui n ' e s t pas encore observ6 le cinqui6me j o u r a p r & t r a i t e m e n t (voir T a b l e a u 5 et Fig. 5). C e p e n d a n t 7 - 9 j o u r s apr~s, les taux de s o d i u m et de chlore plasmatiques subissent une d i m i n u t i o n tr~s significative de l ' o r d r e de 15 ~ 30 p o u r cent. E n g6n6ral, les poissons adapt6s ~ l'eau d o u c e TABLEAU 5 - - E v o L U T I O N DE LA CONCENTRATION DU SODIUM ET DU CHLORE PLASMATIQUES SOUS L~EFFET DE DIVERS ANTIBIOTIQUES

n

Na

C1

Moyenne ± E.S. Moyenne ± E.S.

130,2 2,43 146,9 2,34

96,9 3,37 131,5 3,57

1. T6moins ad. eau douce

25

2. T6moins ad. eau de mer

25

3. T6moins apr& 10 h en eau de mer

11

Moyenne ± E.S.

146,3 4,05

127,4 3,14

4. Actinomycine: 50/~g, 5 i~me jour, ad. eau douce

8

Moyenne _+E.S.

127,6 3,49

102,3 4,26

Actinomycme: 50/zg, 7-9 i&ne jour, ad. eau douce

4

Moyenne ± E.S.

110,8~ 5,35

74,5* 8,42

5. Actinomycme: 50-60/zg, 4-6 i6me jour aprbs traitement, ad. eau de mer

6

Moyenne ± E.S.

218,55 13,73

208,5~ 11,34

6. Actinomycine: 50/zg, 2 h, aprbs 10 h en eau de mar

2

Moyenne

147

134

7. Actinomycine: 50/zg, 12 h, apr6s 10 h e n eau de mer

2

Moyenne

175++

136

8. Actinomycme: 50/zg, 26-30 h, apr6s 10 h e n eau de mer

8

Moyenne ±E.S.

170,5++ 6,10

148,9 5,31

Actinomycme: 50/zg, 26-30 h, apr6s 4 jours en eau de mer

4

Moyenne + E.S.

217,8,* 11,52

216,8.+ 8,64

9. Actinomyclne: 60/zg doses fractionn6es ou unique, 5 jours ~ 15 h avant transfert 10h en e a u d e m e r

5

Moyenne +E.S.

180,6++ 10,12

143,0t 3,14

10. Puromycine: 750/zg, 2 h , 10h en eau de mer

4

Moyenne _+E.S.

135,3 2,00

123,5 4,70

Comparaison statistique entre groupes ad. eau douce, ad. eau de mer ou en cours d'adaptation en eau de mer (* P < 0 , 0 5 ; t P < 0 , 0 2 ; + P < 0 , 0 1 ) conc. l'effet du traitement.

LES A N T I B I O T I Q U E S ET L'OSMORI~GULAT1ON DE L ' A N G U I L L E

1135

survivent plus d'une semaine aprbs le traitement, certains survivent plus de deux semaines. Cependant une 6tude statistique pr6cise de la mortalit6 reste ~ faire. (d) Transfert eau douce-eau de met. Au cours du transfert eau douce-eau de mer, on assiste ~ un r6ajustement progressif du flux sortant de sodium (voir Motais, 1967). U n groupe de onze anguilles intactes a servi de t6moin permettant la comparaison avec les animaux trait6s (groupe 1, Tableau 4). L e flux sortant mesur6 d'abord pendant 1 h dans le milieu d'adaptation (El)) puis pendant 10 h cons6cutives en eau de mer (EM1, E M 2. . . . . EMlo ). On constate que, comme l'illustre la Fig. 4, le flux sortant augmente progressivement suivant une courbe en F$ 1.500

|'



P

I000

500

[

--

/5r "

ED"F_NI

.5

10

20

30

FIG. 4. Evolution du flux sortant de sodium au cours du transfert eau douce-eau de mer. Effets compar6s de l'actinomycine D (A) et de la puromycine (P) (Tableau 4). Le flux sortant en/z6quiv./h par 100 g en fonction du temps en heures (h). C, animaux t6moins. Les animaux A ont regu l'antibiotique 24-32 h avant le transfert; les animaux P, 2 h avant transfert. A gauche (temps 0) flux en eau douce puis flux en eau de met (1-10 h puis 24-32 h apr~s transfert). S. A la dixi~me heure le flux sortant atteint environ 50 pour cent du flux h l'6quilibre. L e lendemain du transfert (24-32 h apr~s) la vitesse de renouvellement du sodium atteint d~jh 28 pour cent de la masse du sodium 6changeable h l'heure correspondant h u n flux sortant de 1200 F6quiv. environ, soit un niveau pratiquement identique h celui des animaux adapt6s (1300 F6quiv.) (comparer avec les niveaux d'6changes des animaux en eau de mer pendant les p6riodes pr6c6dant les

1136

J. MAETZ,J. NIBELLE, M. BORNANCIN ET R. MOTAIS

traitements: Tableaux I, 6 et 7). Apr6s un s6jour de I0 h en eau de mer, les concentrations plasmatiques de Na et C] augmentent de mani6re significative(voir Tableau 5: P< 0,01 pour Na et P< 0,001 pour CI) et deviennent comparables fi ceux des animaux adapt6s ~ l'eau de mer. Chez les animaux trait6s par l'actinomycine, si le traitement est donn6 2 h avant le transfert en eau de mer (deux animaux), aucune perturbation de l'6volution du flux sortant n'est observ6e, ni au cours des 10 h suivant le transfert, ni 24 h plus tard, les taux de renouvellement calcul6s (20 et 29 pour cent/h) 6tant comparables fi ceux que l'on observe chez des t6moins. De m~me, la concentration des 61ectrolytes plasmatiques mesur6e 10 h apr6s transfert est tr~s comparable fi celle des animaux t6moins (Tableau 5). Cependant 48 h plus tard, les vitesses de renouvellement du sodium chez ces animaux sont anormalement basses (11 et 13 pour cent alors que les t6moins ont des taux 6chelonn6s entre 25 et 35 pour cent. Ces anguilles meurent au cours de la semaine suivant le transfert. Chez les deux anguilles ayant requ l'actinomycine 12 h avant le transfert (Tableau 4), on observe chez l'une une 6volution du flux sortant conforme ~ celle des t6moins alors que la seconde prdsente 10 h apr6s transfert un flux sortant anormalement bas (80/zg). Cependant la natr6mie de ces deux animaux est anormalement ~lev6e alors que la chlorfmie est normale. Ces animaux meurent aussi dans la semaine suivant le transfert. Chez les huit animaux ayant regu l'actinomycine 26-30 h avant le transfert en eau de mer on constate que le flux sortant de sodium n'augmente que tr~s lentement. Alors qu'il est huit fi neuf fois plus 61ev6 au cours de la dixi~me heure par rapport la premiere heure chez les t6moins, il n'est que deux lois plus 6lev6 chez les animaux trait6s dans ces conditions. La concentration de sodium et de chlore plasmatique est anormalement 61ev6 chez ces animaux (Tableau 5), ce qui illustre la perturbation du r6ajustement des 6changes ioniques produite par l'antibiotique. Le lendemain du transfert la vitesse de renouvellement du sodium reste anormalement basse 7,2 pour cent/h en moyenne, ce qui correspond 5 un flux sortant de l'ordre de 340/~6quiv. La Fig. 4 illustre l'6volution du flux sortant chez ces animaux et la comparaison avec les animaux intacts. Tous les animaux meurent dans la semaine suivant le transfert et la concentration des 61ectrolytes plasmatiques chez les quatre animaux survivants 4 jours apr~s transfert atteint un niveau extr6mement 61ev6 (volt Tableau 4) comparable fi celui observ6 chez les animaux adaptds h l'eau de mer et traitds par l'actinomycine. La perturbation de l'osmor6gulation semble donc irrfversible. Des observations analogues ont fit6 recueillies chez les anguilles ayant requ 60/~g d'actinomycine soit en doses fractionn6es quotidiennes, soit en une dose unique 4-5 jours avant le transfert (voir Tableau 4 et Tableau 5). Ces animaux sont morts 46--72 h apr~s transfert en eau de met. Signalons que le Tableau 4 illustre aussi le fait que le flux sortant des anguilles en eau douce est consid6rablement plus 61ev6 apr~s action de l'actinomycine. L'augmentation est d'autant plus importante que le d61ai apr~s l'injection est plus grand. Chez les deux animaux 6tudi6s 12 h apr~s l'injection, il est int6ressant de

LES ANTIBIOTIQUES ET L'OSMOR~GULATION DE L'ANGUILLE

1137

noter que l'animal, dont le r6ajustement du flux est perturb6 apr~s passage en eau de mer, est 6galement celui dont le flux sortant en eau douce est anormalement 61ev6 (60/~6quiv.). Le flux sortant du second est de 16/z6quiv. comparable aux t6moins. 2. Action de la puromycine et de la cycloheximide

(a) Poissons adaptds ~ l'eau de mer. Trois groupes de poissons ont 6t6 trait6s par une seule dose d'antibiotique. Le groupe 1 (douze animaux) a re~u 7501000/~g/100 g de puromycine alors que le groupe t6moin (huit animaux) a 6t6 trait6 par le nuel6oside de la puromycine (500/~g). Le groupe 3 (neuf animaux) a regu une dose de 30/zg de cycloheximide. Tous ces animaux ont surv6cu pendant au moins 15 jours au traitement. Le Tableau 6 et la Fig. 6 rassemblent les donn6es relatives aux effets de ces antibiotiques sur l'intensit6 des 6changes de sodium. On constate que la cycloheximide et la puromycine produisent une augmentation de la vitesse d'6change du sodium d~s les 2 h apr~s injection. Pour la puromycine cette augmentation est encore observable 24 h apr&s l'injection. L'effet est plus fugace ou plus inconstant pour la cycloheximide. Par contre, le d6riv6 nucl6oside reste sans effet significatif sur les dchanges de sodium. (b) Poissons en cours de transfert eau douce-eau de mer. Les effets de la cycloheximide et de la puromycine n'ont pas 6t6 6tudi6s sur des animaux adapt6s l'eau douce. U n seul groupe de quatre poissons d'eau douce a regu un traitement de 750/~g/100 g, 2 h avant transfert en eau de mer et les flux sortants de sodium ont 6t6 6tudi6s au tours de l'adaptation. Le Tableau 4 r6sume les observations recueiUies et la Fig. 4 illustre les r6sultats. On constate que cet antibiotique produit une acc616ration du rdajustement du flux sortant; celui-ci est environ trois lois plus 61ev6 que chez les t6moins (9 h 10 h apr~s transfert). I1 est 6gal ou sup6rieur m~me au flux sortant que l'on observe chez les animaux adapt6s depuis longtemps en eau de mer. La concentration des 61ectrolytes plasmatiques reste aussi bien pour le sodium que pour le chlore dans la gamme de celle des animaux t6moins (Tableau 5 et Fig. 5). 3. Action de la mitomycine C

L'action de la mitomycine n'a 6t6 6tudi6e que chez les animaux adapt6s l'eau de mer en comparaison avec les effets de l'actinomycine qui produit un ralentissement des 6changes de sodium dont les effets peuvent ~tre observ6s d~s les second ou le troisi~me jour. Une s6rie de cinq poissons a regu des doses biquotiennes de mitomycine 1 et 15 h avant les mesures de flux. Les doses ont 6t6 d'abord de 100/zg puis de 200/zg. Le Tableau 7 regroupe les observations recueillies. On constate que la vitesse de renouvellement du sodium n'est pas modifi6e de mani~re significative pendant les 4 jours du traitement. Quatre animaux sont morts 2 h 3 semaines aprbs le d6but du traitement. U n animal est mort au quatri6me jour sans pour autant pr6senter de perturbation notable des 6changes de sodium.

1138

J. ~/IAETZ, J. NIBELLE, NI. BORNANCIN ET R. MOTAIS N a int od E M

4~

od E D

ED-EM

20(

A

A26-o

10h

] 5 0 - - -

c

A5 j

10h

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C

A2h

A26-31i) __ h 10h P2h

\,?,, ,,

A7-9i -

100---'

:i(!

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5C--

)i:2L; FIG. 5. Evolution de la concentration du s o d i u m plasmatique chez l'anguille adapt6e h l'eau douce (ad. ED), en cours d'adaptation h l'eau de mer (ED ~ EM) et adapt6e h l'eau de mer (ad. EM). Effet de l'actinomycine D (A) et de la puromycine (P) (voir Tableau 5). C, animaux t~moins. As, 1. . . . A7-9~, P2h, en indice, le 10h

10h

4jours

n o m b r e de jours ou d'heures suivant le traitement. C, P, A, chiffre au dessus de C, P ou A: nombre d'heures ou de jours apr~s transfert d'eau douce en eau de mer. [Na]i1~t e n m-dquiv./l.

30 ¸

20 ......................

Jo 1

3

s

7

s

Jo

1

3

$

FIC. 6. T a u x de renouvellement (T.R. en pourcentage du s o d i u m 6changeable l'heure) en fonction du temps (en jours). Action compar6e de la puromycine P, du d6riv6 nuel6oside de la puromycine N P et de la cycloheximide C (Tableau 6). Jo, mesure de flux t6moin. Injection (fl~che) de l'antibiotique et mesure de flux 2 h apr~s le traitement puis 24 h (J1), 48 h (J~), etc., apr6s.

26,8 3,71 8 22,7 3,00 9

Taux moyen + E.S. n Taux moyen + E.S. n

2. Nucl6oside (500/zg)

3. Cycloheximide (30/~g)

29,9 2,70 8

24,1 3,17 8

34,7 2,99 12

Y~

24,2 3,23 9

24,2 3,11 8

34,7 2,98 12

Y,

27,5 2,97 9

24,7 4,30 7

32,7 3,68 12

Y.

25,4 2,89 9

----

----

Y,

Les injections d'antibiotiques ont 6t6 faites entre fro etffl, 2 h avant la mesure de flux en fflComparaisons statistiques pour les valeurs appari6es: Effet de la puromycine : fro-fib P < 0,01 ; ff0-ff,, P < 0,02 ; fro-if3 etc, n o n significatif. Effet de la cycloheximide: floe]t1, P < 0,01, J0-ff,, n o n significatif. Effet du nucl6oside: ff0-a71, n o n significatif. T a u x de renouvellement en pour cent/h.

27,4 1,91 12

Taux moyen + E.S. n

Y0

Y~

22,6 1,38 9

22,4 4,38 8

31,0 2,11 5

T e m p s en jours

DE RENOUVELLEMENT DU SODIUM D~ANGUILLES EN EAU DE MER

--

28,9 2,69 10

Y~

27,5 4,46 8

Y~

COMPAP~E DE LA M I T O M Y C I N E , DU NUCLEOSlDE DE LA PUROMYCINE ET DE LA CYCLOHEXIMIDE SUR LA VITESSE

1. Puromycine (750/,g)

TABLEAU 6 - - A C T I O N

t~

r*

Z

>

O

t~

1140

J. MAETZ,J. NIBELLE, M. ]3ORNANCINET R. MOTAIS

TABLEAU 7 - - A C T I O N

DE LA M I T O M Y C I N E SUR LA VITESSE DE 1RENOU'~rELLEMENT DU SODIUM CHEZ L ' A N G U I L L E EN EAU DE MER

Temps en jours

Fraction renouvel6e

Moyenne _+E.S. n

Y-1

Jo

3'1

Y~

Y3

Y4

30,9 3,26 5

30,6 3,06 5

31,8 5,40 5

36,7 5,45 5

37,4 7,54 5

36,3 6,39 4

Un animal est mort entre J3 etJ4. Doses de 100/~g administr~es 15 et 1 h avant les mesures fi partir de J0 et de 200/zg partir de J v Fractions renouvel6es en pour cent/h. DISCUSSION

1. Analyse des effets des antibiotiques L'objet du pr6sent travail a 6t6 de v6rifier si divers antibiotiques connus pour interf6rer directement ou indirectement avec la synth+se des prot6ines 6talent susceptibles de perturber les m6canismes de l'osmor6gulation chez l'anguille adapt6e ou en cours d'adaptation h des milieux de salinit6 vari6e. Chez l'anguille adapt6e en eau de mer, l'actinomycine D produit une inhibition progressive des 6changes et de l'excr6tion de sodium dont la branchie est le si+ge. T o u s l e s poissons meurent dans les 8 jours suivant le d6but du traitement avec une concentration plasmatique du sodium et du chlore anormalement 61ev6e. La mitomycine, antibiotique bloquant la division cellulaire ne produit pas de perturbation des m6canismes osmor6gulateurs et les animaux trait6s par cet antibiotique survivent g6n6ralement plus d'une semaine apr+s le traitement. La puromycine et la cycloheximide, par contre, activent les 6changes de sodium et les animaux survivent bien au traitement, du moins aux doses utilisfes dans le pr6sent travail. Chez l'anguille adapt6e h l'eau douce, les doses d'actinomycine qui se sont av6r6es 16tales chez les animaux en eau de mer semblent ~tre nettement mieux tol6r6es. Tous les animaux survivent au traitement pendant au moins une semaine et certains plus d'un mois. Les perturbations de l'osmor6gulation sont plus discr+tes. Elles consistent essentiellement en une augmentation du flux sortant dont l'origine r6nale, branchiale ou cutan6e reste ~ pr6ciser. Le flux entrant reste intact, du moins apr~s un d61ai de 4 ~ 5 jours suivant l'instauration du traitement, d61ai qui chez les animaux adapt6s ~ l'eau de mer correspondrait une r6duction tr~s importante de l'efficacit6 de la pompe d'excr6tion du sel. Durant le transfert d'eau de mer h l'eau douce, l'actinomycine D supprime quasi-totalernent la r6duction instantande de flux sortant que l'on observe normalement et qui caract6rise le m6canisme de diffusion par 6change (Motais et al., 1966). On observe de plus que la r6gulation diff6r6e, qui correspond normalement ~ une imperm6abilisation progressive de la branchie, est 6galement abolie. Mais le d61ai

LES ANTIBIOTIQUES ET L~OSMORI~GULATION DE L'ANGUILLE

1141

n6cessaire et suftisant s6parant le traitement et le changement de milieu pour que l'antibiotique soit efficace sur ce processus, n'a pas 6t6 recherch6. La comparaison des effets de la puromycine et de l'actinomycine D sur la balance min6rale en eau douce reste 6galement fi 6tudier. En d6finitive, la comparaison des effets de l'actinomycine sur l'osmor6gulation de l'anguille en eau douce et en eau de mer confirme que les pompes d'absorption et d'excr6tion de sel qui op&rent alternativement dans la branchie sont ind6pendantes et que la pompe d'excr6tion ionique en eau de mer semble ~tre li6e ~t l'existence du m6canisme de diffusion par 6change. La suppression quasi-totale de la r6gulation instantan6e qui intervient au cours du transfert eau de mer-eau douce n'est que le reflet de la disparition progressive du transporteur responsable de ce m6canisme. Pendant le transfert inverse, l'actinomycine D ralentit ou bloque le r6ajustement progressif du flux sortant que l'on observe normalement chez les animaux en cours d'adaptation fi l'eau de mer. Le d61ai n6cessaire et suffisant pour que cette perturbation soit observ6e et qui s6pare le traitement et le changement de milieu est de 24 fi 30 h pour une dose de 50/~g. La puromycine, inject6e 2 h avant le transfert, produit au contraire une acc616ration du processus de r6ajustement. Les effets contraires de la puromycine et de l'actinomycine seront discut6s plus loin.

2. Action directe ou indirecte des antibiotiques sur les effecteurs de l'osmordgulation Plusieurs remarques g6n6rales sont fi faire en ee qui concerne nos observations sur les effets des antibiotiques in vivo. Les effets tr~s nets obtenus sur l'osmor6gulation de l'anguille ne sont pas a priori le reflets d'une action directe de l'antibiotique sur les effecteurs de l'osmor~gulation. Ils pourraient r6sulter ~ventuellement de leur toxicit6 g6n6rale qui seeondairement alt6rerait les processus de l'osmor6gulation. Mais divers arguments viennent fi l'encontre d'une telle interpr6tation de nos r~sultats. Ainsi l'actinomycine D devrait avoir la m~me toxicit~ g6n6rale chez l'anguille en eau douce comme en eau de mer et pourtant la survie des animaux est beaucoup plus longue en eau douce, milieu dans lequel les perturbations de l'osmor6gulation sont aussi plus discr~tes. I1 reste possible que l%limination de l'antibiotique par le rein soit plus effieace en eau douce, car la filtration glom6rulaire est nettement plus importante dans ee milieu (Rankin, 1967). Cependant certains de nos protocoles exp6rimentaux correspondent ~ des administrations chroniques qui devraient obvier ~ eette 61imination plus rapide. De plus, une dose unique d'actinomycine administr6e 4-5 jours avant le transfert en eau de mer produit apr~s passage dans ce milieu une inhibition earact~risfie du r6ajustement du flux sortant et l'animal ainsi trait6 meurt quelques jours apr~s son transfert dans le milieu de salinit6 61ev6e et done un dysfonctionnement des membranes biologiques en contact avec ce milieu paralt probable. Cependant ce dysfonctionnement pourrait r6sulter d'une action indireete sur ces membranes par l'interm6diaire d'une perturbation de leur eontr61e endoerinien. De fair, il faut noter que les effets de l'actinomycine D chez l'anguille en

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J. MAETZ,J. NIBELLE,M. BORNANCINET R. MOTAIS

eau de mer ou en cours d'adaptation ~ ce milieu ressemblent de mani6re frappante ceux produits par l'ablation de la surr6nale. Mayer et al. (1967) dans notre laboratoire ont montrd que la surr6nalectomie produit un ralentissement des ~changes branchiaux de sodium et de l'excrdtion de sel dont la branchie est le si6ge. Les anguilles ne peuvent survivre en eau de met aprSs ablation de cette glande et elles prdsentent une dldvation anormale de la concentration des dlectrolytes plasmatiques. On observe ~gatement un ralentissement du rdajustement du flux sortant branchial lors du transfert d'eau douce en eau de mer. La comparaison des effets de la surr~nalectomie et de ceux de l'actinomycine sugg6re que cet antibiotique pourrait produire une surrdnalectomie pharmacologique. Or Leloup-Hatey (1968) vient r~cemment de montrer que chez l'anguille hypophysectomisde cet antibiotique est effectivement susceptible de bloquer la r~ponse st~roidogdnique de la surrdnale h l'hormone adr~nocorticotrophique, A C T H aussi bien in vivo qu'in vitro. Chez les Mammif+res, le blocage de cette r6ponse a dt~ observ~ in vitro chez les ovins par Farese (1966) mais non chez le rat sauf si le traitement ~ l'actinomycine D est prolong6 (Garren et al., 1965, et Ney et al., 1966: observations in vivo; Ferguson & Morita, 1964, et Farese, 1966: observations in vitro). Ney et al. sugg~rent que le "template RNA" des glandes surr6nales de rat est hdt6rog6ne. La fraction responsable de la rdponse stdroidog6nique rapide I'ACTH est relativement stable, alors que la majeure partie du RNA est instable. I1 est important de noter que la puromycine et la cycloheximide qui op+rent au niveau de la traduetion ribosomale sont dgalement des inhibiteurs de la r~ponse ~ la corticotrophine chez le rat (Garren et al., 1966) et qu'il est probable que ces antibiotiques agissent sur les surr~nales de toutes les esp~ces de Vertdbrds et notamment chez l'anguille. Or chez cette esp~ce, la puromycine et l'actinomycine D ont des effets totalement opposds sur l'osmor~gulation. Cette constatation nous sugg~re que le dysfonctionnement de l'osmordgulation produit par l'actinomycine D ne r6sulte pas de l'inhibition de la r6ponse st~roidog~nique ~ la stimulation hypophysaire. En outre, les antibiotiques ne suppriment pas la sdcrdtion surr~nalienne de base, du moins chez les Mammif~res (Farese, 1966). Or chez l'anguille hypophysectomisde adaptde ~ l'eau de met, Maetz et al. (1967) ont observ6 que l'absence de corticostimuline endog~ne ne produit qu'une perturbation limit~e de l'osmor~gulation et d'ailleurs l'anguille survit tr6s bien ~ l'hypophysectomie en eau de met. L'effet de l'actinomycine sur l'osmor~gulation est nettement plus important. I1 faut remarquer en outre que Leloup-Hatey (1968) signale qu'une dose de 10/zg/100 g d'actinomycine D ne produit qu'un blocage temporaire de l'ordre de 5 h de la r~ponse stdroidogdnique. Or nos observations sur les effets de l'actinomycine portent sur des animaux qui re~oivent 10/~g par 24 h. Si les doses sont plus dlev~es, les effets sont ~tudi~s 3 ~ 4 jours apr~s l'injection. I1 est probable que ces protocoles exp~rimentaux ne correspondent qu'~ un blocage tr~s partiel dans le temps de l'action de la corticostimuline endog~ne. Signalons en outre qu'en eau douce la surrdnalectomie produit une r6duction tr~s nette du flux entrant de sodium chez l'anguille (Chan, 1967; Maetz, 1969) alors que l'actinomycine D reste sans effet

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sur ce param&re de la balance min~rale. Finalement nous avons observ~ que l'injection d'actinomycine D ~ des anguilles hypophysectomis~es recevant du cortisol de mani~re chronique produit apr~s un d~lai de quelques jours un ralentissement des ~changes de sodium en eau de mer et la mort des anguilles dans les 3-4 jours suivant l'instauration du traitement malgr~ l'injection de cortisol (Maetz, 1969). Un autre effet indirect qui a ~t~ signal~ pour la puromycine est son action sur la fonction glycog~nique du role. Certains de ces effets ont ~t~ faussement assign~s son action sur le m~canisme de la traduction de l'information g~n&ique au niveau du ribosome alors que c'~tait le blocage de cette fonction [email protected] qui &ait en cause (Hofert & Boutwell, 1963 ; Staehelin, 1965). Mais cet effet non sp~cifique est ~galement produit par l'aminocucl~oside de la puromycine. Or ce d~riv~ reste sans action sur l'osmor~gulation de l'anguille. De plus, la cycloheximide qui ne semble pas avoir sur le foie ce type d'action non sp~cifique produit une perturbation en tout point comparable ~ celle de la puromycine sur les ~changes de sodium de l'anguille. Ces observations nous incitent ~ penser que ces antibiotiques agissent directement sur les effecteurs de l'osmor~gulation. Parmi les effets directs possibles de l'actinomycine D sur les effecteurs de l'osmor~gulation, il convient de consid~rer en premier lieu son pouvoir d'inhiber la division cellulaire. Kishimoto & Lieberman (1964), Melvin (1967), Donnelly & Sisken (1967) et plus r~cemment Frankfurt (1968) et K i m et aL (1968) parmi d'autres ont ~tudi~ les effets de l'actinomycine D sur le cycle de renouvellement cellulaire dans des cultures de tissus ou organes en vole de regeneration chez les Vertebras Sup~rieurs. Tous ces auteurs concluent formellement que la synth~se de m R N A et de certaines prot~ines est indispensable ~ la cellule pour entrer en mitose. Or, selon les observations de Conte & Lin (1967), le passage d'eau douce en eau de mer induirait une acceleration de la vitesse de renouvellement cellulaire de l'@ith~lium branchial. Les cellules concern~es par cette induction seraient surtout les cellules riches en mitochondries c'est-~-dire les "cellules ~ chlorure" qui un r61e important dans les m~canismes d'excr~tion du sel a ~t~ assign~ depuis les observations initiales de Keys & Willmer (1932). Ce r61e est d'ailleurs mis en doute par certains auteurs (Parry, 1966). Quoi qu'il en soit, les observations ant~rieures de Conte (1965) concernant les effets des rayonnements X sur l'osmor~gulation du saumon Oncorhynchus sugg~raient d~j~ un renouvellement cellulaire plus rapide de certaines ceUules jouant dans la branchie un r61e osmor~gulateur important en eau de mer. Ces cellules seraient pr~cis~ment les plus radio-sensibles. I1 est suggestif que les doses l~tales de rayonnement sont nettement moins ~lev~es en eau de mer qu'en eau douce. De plus, l'irradiation produit des perturbations caract~ris~es de l'osmor~gulation en eau de mer et non en eau douce. En particulier, la concentration du sodium et du chlore plasmatiques est anormalement ~lev~e chez les saumons irradi~s en eau de mer. Nos observations sur les effets et la toxicit~ de l'actinomycine D chez l'anguille en rapport avec la salinit~ du milieu exterieur sont tr~s semblables. Contte & Lin (1967) ~ qui nous avions communiqu~ nos r~sultats pr~liminaires sur les effets de cet antibiotique pensent qu'ils sont

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assigner au pouvoir mitolytique de celui-ci. Cependant divers arguments s'opposent une telle interpretation de nos observations faites sur l'anguille. En effet, la puromycine et la cycloheximide s'av+rent ~galement efficaces pour bloquer la synth~se du D N A et la division cellulaire, du moins sur les cultures de tissus des Mammif~res (Kishimoto & Lieberman, 1964; Donnely & Sisken, 1967; Kim et al., 1968). Or la puromycine et la cycloheximide produisent une perturbation de l'osmor~gulation de nature totalement diff6rente de celle eaus6e par l'actinomycine D. De plus la mitomycine, qui s'av+re un antibiotique ayant des activit6s mitolytiques par excellence, reste sans effet sur les 6changes branchiaux de sodium en eau de mer. I1 faut signaler aussi d'autre part que les observations pr61iminaires de Melle Olivereau et de Mr. Masoni (communication personnelle) ont montr6 que chez l'anguille, le nombre de cellules en voie de renouvellement paralt peu 61ev6 aussi bien en eau douce qu'en eau de mer. Au cours du passage eau douce-eau de mer, en particulier, on observe une recrudescence des divisions cellulaires au cours du troisi+me jour apr~s transfert alors que nos 6tudes cin6tiques montrent que d~s le second jour, la vitesse de renouvellement du sodium a atteint la valeur d'~quilibre caract~ristique des animaux adapt6s ~ l'eau de mer. De nouvelles recherches biochimiques ou radioautographiques sur la vitesse de renouvellement de D N A branchial et sur le marquage cellulaire par thymidine triti~e sont n6cessaires pour v6rifier si les m6canismes cellulaires ou mol~culaires de l'adaptation de l'~pithdlium branchial ~ des milieux de salinit6 61ev6e sont diff6rents chez le saumon et l'anguille. La Fig. 7 illustre les diff~rentes possibilit~s--induction d'un renouvellement cellulaire ou d'un renouvellement mol~culaire--qui pourraient ~tre en cause lors de l'adaptation de la branchie h des milieux de salinit6 ~lev~e. Signalons enfin que l'effet mitolytique des antibiotiques pourrait aussi concerner un autre effecteur de l'osmor6gulation ~ savoir l'intestin qui joue un r61e important dans l'absorption d'eau et de set au cours de l'adaptation en eau de met (Smith, 1930; Skadhauge & Maetz, 1967). Cet organe qui est le si~ge d'un renouvellement eellulaire particuli~rement rapide (Vickers, 1962) et qui de ce fait s'av+re particuli~rement radiosensible (Conte, 1965) est tr+s probablement perturb6 dans son fonetionnement par l'injection d'actinomycine D. I1 est certain qu'une inhibition des m~canismes d'absorption d'eau intestinale qui ne viendrait plus ~ compenser les pertes d'eau par osmose au niveau de la branchie produirait tr+s probablement une 616vation anormale des concentrations des osmolytes internes. Cependant, le ralentissement des ~changes branchiaux de sodium que nous observons apr+s action de l'actinomycine ne pourrait en aucun cas r6sulter d'un effet primaire sur l'intestin et d'une 616vation anormale de la concentration des ~lectrolytes plasmatiques. En effet, Mayer et Nibelle (dans notre laboratoire) ont montr~ sur l'anguille que toute 616ration exp6rimentale de la concentration du sodium plasmatique produit une acc616ration des 6changes branchiaux de sodium (travail en preparation). Par ailleurs, la puromycine ou la mitomycine 6galement mitolytiques produisent des effets totalement opposes ou restent sans effet sur l'osmor6gulation de l'anguille alors que les fonctions intestinales devraient ~galement 8tre perturb~es comme pour l'actinomycine D.

1. Hypoth6se du RENOUVELLEMENTCELLULAIRE(Conte & Lin, 1967) I n d u c t i o n - - - ~ Division des " I O N O B L A S T E S " - - - - > Diff6renciation des " I O N O C Y T E S " -> Synthbse du transporteur Synth~se et replication du DNA Transcription et traduction de mRNA 2. Hypothbse du RENOUVELLEMENTMOLECULAIRE(present travail) A. Induction -+ D6repression du D N A des ionocytes - ÷ Synthbse et traduction de ~ Synth~se du transporteur mRNA -~ Synthbse de transporteur B. Induction --> D6repression de RNA cytoplasmique -> Traduction de ce m R N A ~Blocage de la synthbse d ' u n ~Synth~se d ' u n represseur de m R N A stable --> Arr6t traduction inhibiteur du transporteur C. Induction --> -~ Synthbse du transporteur ( Synth~se continue h partir d ' u n m R N A instable Fro. 7. Sch6ma des 6v&nements possibles qui accompagnent le transfert d'eau douce en eau de mer et l'adaptation {tce milieu. Hypoth~se de C o n t e & Lin (1967). Le passage en eau de mer induirait u n renouvellement cellulaire de l'6pith61ium branchial. Des ionoblastes se divisent et se dif[6rencient pour donner des ionocytes ou "cellules ~ chlorure". I1 y a donc induction de synth&se de DNA, replication, division cellulaire, diff6renciation des ionocytes avec synth~se de prot6ines nouveUes (enzymes, transporteur ou permease) en rapport avec les propri6t~s nouvelles osmor6gulatrices de ces cellules. Hypotheses discutdes dans le prdsent travail. Le passage en eau de mer induirait simplement u n renouvellement mol6culaire des cellules {t chlorures, soit h la suite d'une "d6r6pression" du D N A nucl6aire avec synth~se de m R N A nouveau qui servirait de "template" h la synth~se de protdines nouvelles (enzymes, perm6ases), soit ~ la suite d'une "d6r6pression" d ' u n m R N A cytoplasmique stable qui permettrait la synth~se de prot6ines nouvelles. La derni~re hypoth~se aussi represent6e dans la figure suivante sugg~re que ]a perm6ase ou le transporteur existerait en eau douce, synthetis6 par u n m R N A instable. Mais en eau douce, ce transporteur serait inop6rant par suite de l'action d ' u n inhibiteur synth6tis6 ~ partir d ' u n m R N A stable. Le passage en eau de mer correspondrait h une disparition partielle de l'inhibiteur par suite de la r6pression progressive du m R N A stable. Les termes "ionoblastes" et "ionocytes" ont 6t6 donn6s par Conte (communication personnelle).

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3. Interpretation des effets contraires de l'actinomycine, de la puromycine ou de la cycloheximide sur l'osmor~gulation de l'anguille Le fait le plus saillant qui ~merge de nos observations est que contrairement toute attente les antibiotiques qui, en principe, interf~rent directement avec la synth~se des prot~ines au niveau du ribosome produisent une acceleration des ~changes de sodium ou du r~ajustement du flux sortant de sodium lors du transfert en eau de mer alors que l'actinomycine D qui, en principe, interfere indirectement avec la synth~se des prot~ines en arr~tant la production du RNA messager produit un ralentissement des ~changes de sodium ou du r~ajustement du flux sortant. De plus, la cycloheximide ou la puromycine produisent leur effet apr~s un d6lai court--quelques heures--alors que l'actinomycine agit apr~s un d~lai d'environ 24 h. Pour interpreter cette contradiction nous admettrons que ces antibiotiques produisent sur l'6pith~lium branchial des effets sp~cifiques et non des effets atypiques tels que ceux signal,s par Harris (1964), Honig & Rabinovitz (1965) et Soeiro & Amos (1966) pour l'actinomycine D. Bien entendu, nous ne voulons que sugg~rer ici une hypoth~se de travail qui devra attendre les v~rifications biochimiques actuellement en cours pour ~tre confirm~e. De plus, nous admettrons que tousles effets observ~s--les variations de l'intensit~ des flux ioniques--sont bien le reflet des variations fonctionnelles de l'activit~ d'un transporteur ionique de nature prot~ique responsable ~ la fois du ph~nom~ne de diffusion par ~change et de l'excr6tion active de sel par la branchie. Comme il a ~t~ soulign6 dans l'introduction, les variations de l'activit~ du transporteur au cours de l'adaptation ~ des milieux de salinit~ vari~e ne sont pas dues ~ des variations de son affinit~ pour le sodium (voir Motais eta[., 1966). Tout se passe comme si le hombre de mol6cules de transporteur pouvait varier en fonction des besoins ou comme si ce transporteur ~tant bloqu~ partiellement ou totalement par un inhibiteur de type non comp6titif. Or les effets contradictoires des divers antibiotiques utilis~s dans le present travail ne peuvent pas avoir d'interpr~tation univoque dans l'hypoth~se d'une synth~se ou destruction du seul transporteur ionique. Seul un module mettant en ~euvre deux molecules fonctionnelles--transporteur et inhibiteur--dont la vitesse de renouvellement serait diff~rente et dont la synth~se se ferait ~ partir d'un pool h6t~rog~ne de mRNA permet d'expliquer ces contradictions. Les Figs. 7 et 8 illustrent un tel module. I1 met ~ profit les observations r~centes de Spirin (1966), Pitot et al. (1965) et Tomkins et al. (1966) concernant l'h~t~rog~n~it~ du mRNA dans les cellules embryonnaires ou dans les tissus de Vertebras sup~rieurs. Ces auteurs ont montr6 que dans le cytoplasme pouvaient c6toyer des mRNA de stabilit~ tr~s diff~rente, c'est-~-dire ayant une vitesse de renouvellement par transcription ~ partir du DNA tr~s diff~rente. De plus le mRNA stable peut ~tre responsable de la synth~se de prot~ines ~ renouvellement tr~s rapide comme c'est le cas de certains enzymes de la glucon~og~n~se du foie de certains mammif~res. Nous sugg~rons que le transporteur ionique branchial est synth~tis~ ~ partir d'un mRNA instable et que tousles deux ont un T½ d'environ 24 h. La synth~se du transporteur est donc sensible ~ l'action de l'actinomycine D. Le transporteur serait bloqu~ totalement en

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eau douce et partiellement en eau de mer par un inhibiteur dont la vitesse de renouvellement serait tr~s rapide (T: de l'ordre de 1-2 h) et dont la synth+se se ferait ~ partir d'un m R N A stable et done relativement insensible ~ l'aetion de l'actinomycine D. La puromycine et la eyeloheximide agiraient bien entendu aussi bien sur les m~canismes de traduction des deux types de mRNA, mais ee qui serait apparent est l'inhibition de la synth~se de la molecule ~ renouvellement le plus rapide, celle de l'inhibiteur du transporteur. Ainsi s'expliqueraient les activations rapides observ~es avec ces antibiotiques, alors que l'aetinomyeine agirait beaueoup plus lentement de mani~re inverse.

mRNAs~ ~ tl/2nh~~ inhibiteur f ~ /f'~ll~ / mRNA \ I ou y ~n°kz%~r~" 4 | pol ymerasbICyclol~eximide//"~2~\ ~ ~ ....porteur mRNA_instable

FIG. 8. ModUle propos6 pour expliquer les effets paradoxaux de l'actinomycine D, de la cycloheximide et de la puromycine. Le transporteur membranaire, responsable h la lois des ph6nombnes de diffusion par 6change et de transport actif, serait bloqu6 par u n inhibiteur. Le transporteur serait synth6tis6 ~t partir de m R N A instable (le T½ du transporteur et du m R N A correspondant serait de 1 ou 2 jours). L'inhibiteur serait synth6tis6 h partir d ' u n m R N A stable alors que sa vitesse de renouvellement (T½ de quelques heures) serait rapide. L'actinomycine D bloquerait progressivement la synthbse du m R N A instable et donc celle du transporteur. La puromycine et la cycloheximide agirait sur les deux m R N A mais l'effet le plus important serait le blocage de la synth~se de l'inhibiteur d'ofl activation des ph6nombnes de transports. En eau de mer, le m R N A stable serait partiellement bloqu6 par u n r~presseur eytoplasmique.

Signalons que Garren et al. (1964) avaient 6galement observ6 un effet paradoxal de l'aetinomyeine D, inverse de eelui produit par la puromycine sur l'induction des enzymes h6patiques de la glucog6n~se par les eortieost6roides ehez le rat. Pour expliquer eette "super-induction" d'enzymes par l'aetinomyeine, Tomkins et al. (1965, 1966) proposent 6galement un module. Ils admettent l'existenee d'un r~presseur eytoplasmique qui eontr61erait le m6eanisme de la traduction

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ribosomale. Le mRNA responsable de la synth~se des enzymes serait relativement stable et insensible 5 l'action de l'actinomycine D. Par contre, la mRNA responsable de la synthbse du [email protected] serait instable, d'o/J la superinduction observ6e sous l'action de cet antibiotique. La puromycine ou la cycloheximide agissant au niveau de la synth+se ribosomale aussi bien de l'enzyme que de son [email protected], l'effet qui pr~vaut est l'inhibition de la synth~se de l'enzyme. Un tel module, mettant en oeuvre un mRNA "masque" ou informosome selon Spirin (1966), ne peut expliquer les effets contradictoires que nous observons sur l'osmor~gulation de l'anguille. En effet, si la puromycine ou la cycloheximide agissaient en produisant une "d~repression" du mRNA responsable de la synth+se du transporteur, elles inhiberaient 6galement cette synth+se. I1 en r~sulterait une diminution progressive des ~changes de sodium en eau de mer contrairement h ce qui est observ& C'est la raison pour laquelle nous avons sugg~r~ un module mettant en oeuvre inhibiteur et transporteur. I1 reste possible que le mRNA stable responsable de la synth~se de l'inhibiteur puisse se trouver/t l'&at "[email protected]" en eau douce et "reprim~" au moins partiellement en eau de mer. Ce represseur repr~senterait une des protfiines inductibles dont Conte & Morita (1968) sugg+rent l'existence en relation avec le transfert du poisson en eau de mer. Le Tableau 7 tient eompte de cette possibilit& Discutons pour finir une derni+re hypoth~se qui expliquerait nos r~suhats eontradictoires. La puromycine agit au niveau des ribosomes en terminant pr6matur~ment la synth+se des chalnes polypeptiques qui sont lib6r~es incompl+tes (Nathans, 1967). Si ces chalnes partielles correspondaient ~t un transporteur fonctionnel, l'activation observ6e ~ la suite du traitement avec cet antibiotique se trouverait expliqu6e. Cependant cette hypoth+se ne peut tenir, car la cycloheximide, qui agit 5 un niveau different de la synth+se prot~inique ribosomale (Sisler & Siegel, 1967), produit 6galement une activation transitoire des 6changes de sodium branehiaux en eau de mer. SUMMARY Several antibiotics inhibiting protein synthesis or cellular division produce significant perturbations of the osmoregulation in the eel within a week of injection. 1. In sea water, actinomycin D produces within a few days a progressive reduction of the sodium turnover rate together with an impairment of the gill salt excretion mechanism. The treated fish die with abnormally high sodium and chloride plasma levels. Puromycin and cycloheximide induce within a few hours a temporary increase of the sodium exchange. No major impairment of the mineral balance can be observed and the treated fish survive. Mitomycin and the aminonucleoside derivate of puromycin remain without effect. 2. After transfer from sea water to fresh water, actinomycin D perturbs both mechanisms characterizing ionic branchial adaptation to fresh water. The instantaneous reduction of the sodium outflux is almost completely abolished as a result of the progressive destruction of the exchange-diffusion carrier observed in sea

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water. T h e secondary regulation which, after a lag period, reduces further the sodium outflux, is no longer observed. 3. I n fresh water, actinomycin D leaves the active component of the salt balance unchanged, while the sodium outflux is augmented. T h e relative roles of gill, skin or kidney in this effect have not been studied. T h e fish survives actinomycin D treatment for more than a week. 4. During transfer from fresh water to sea water, actinomycin D retards or blocks the sodium outflux readjustment which is normally observed. T h e treated fish die within a few days after transfer, with abnormally high internal sodium and chloride levels. T o obtain the impairment of the sodium outflux readjustment pattern, actinomycin D has to be injected at least 24 hr before transfer. Puromycin injected 2 hr before transfer significantly speeds up the sodium outflux readjustment. T h e treated fish survive after transfer in sea water. 5. T h e significance of these observations is discussed in terms of unspecific toxic effects or specific effects of the antibiotics, of an indirect or direct action on the effectors of osmoregulation, and of perturbance of the cellular or molecular renewal of the gill epithelium in relation to external salinity changes. 6. T h e contrary effects of antibiotics which are supposed to interfere directly (puromycin, cycloheximide) or indirectly (actinomycin D) with protein synthesis are also discussed. A model is proposed suggesting two m R N A s with different half-lives acting as templates for the synthesis of an ionic transport and exchange diffusion carrier and of a non-specific inhibitor of this carrier. T h i s model would explain the observed variations of the activity but not of the affinity of the transport carrier for sodium in relation to external salinity changes.

Remerciements--Nous remercions nos coll~gues le Dr. F. Conte, le Dr. P. Fromageot et ses coltaborateurs qui se sont int6ress6s h ce travail et qui nous ont aid~ par leur discussions stimulantes. Mr. Tanguy a ~t6 le responsable des installations 61ectroniques permettant les mesures de cin6tique isotopique. REFERENCES CHAN D. K. O. (1967) Ph.D. thesis, University of Sheffield. CONTE F. P. (1965) Effects of ionizing radiation on osmoregulation in fish Oncorhynchus kisutch. Cornp. Biochem. Physiol. 15, 293-302. CONTE F. P. • LIND. H. Y. (1967) Kinetics of cellular morphogenesis in gill epithelium during sea water adaptation of Oncorhynchus (Walbaum). Cornp. Biochem. Physiol. 23, 945-957. CONTE F. P. & MORITA T. N. (1968) Immunochemical study of cell differentiation in gill epithelium of euryhaline Oncorhynchus (Walbaum). Cornp. Biochem. Physiol. 24, 445454. DONNELLY G. M. & SISKENJ. E. (1967) RNA and protein synthesis required for entry of cells into mitosis and during the mitotic cycle. Exp. Cell Res. 46, 93-105. FARESE R. V. (1966) Effect of actinomycin D on ACTH-induced corticosteroidogenesis. Endocrinology 78, 929-936. FERGUSON J. J., JR. & MORITA Y. (1964) RNA synthesis and adrenocorticotropin r e s p o n siveness. Biochim. biophys. Acta 87, 348-350. FRANKFURTO. S. (1968) Effect of hydrocortisone, adrenalin and actinomycin D on transition of cells to the DNA synthesis phase. Exp. Cell Res. $2, 220-232.

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Key Word Index--Ionic exchange across gill epithelium; osmoregulatory mechanism in euryhaline fish; molecular or cellular renewal in gill epithelium; inhibitors of protein synthesis; mitolytic substances; ionic transfer carrier and inhibitor of carrier; isotopic kinetic study of outflux readjustment during transfer from fresh water to sea water and vice versa; eel; Anguilla anguilla.