Évolution des souches de Rotavirus du groupe A en circulation en Tunisie sur une période de trois ans (2005–2007)

Évolution des souches de Rotavirus du groupe A en circulation en Tunisie sur une période de trois ans (2005–2007)

Pathologie Biologie 59 (2011) e79–e83 Article original E´volution des souches de Rotavirus du groupe A en circulation en Tunisie sur une pe´riode de...

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Pathologie Biologie 59 (2011) e79–e83

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E´volution des souches de Rotavirus du groupe A en circulation en Tunisie sur une pe´riode de trois ans (2005–2007) Evolution of group A Rotavirus strains circulating in Tunisia over a 3-year period (2005–2007) A. Chouikha a,b, M. Ben Hadj Fredj b, I. Fodha b, I. Mathlouthi b, M. Ardhaoui b, N. Teleb c, I. Brini d, F. Messaadi e, M. Mastouri f, T. Sfar g, M. Hachicha h, T. Kammoun h, A. Bouaaziz i, F. Amri j, A. Harbi k, M. Zribi e, S. Bousnina d, A. Khemakhem l, N. Boujaafar b, A. Trabelsi a,b,*, A.D. Steele m a

Laboratoire MDT-01, faculte´ de pharmacie, Monastir, Tunisie UR06/SP20, laboratoire de microbiologie, CHU Sahloul, 4059 Sousse, Tunisie Service de pe´diatrie, hoˆpital d’Enfants, Tunis, Tunisie d Vaccine Preventable Diseases and Immunization, WHO/EMRO, Le Caire, E´gypte e Laboratorire d’Hygie`ne, CHU Hedi Chaker, Sfax, Tunisie f Laboratoire de microbiologie, CHU Fattouma Bourguiba, Monastir, Tunisie g Service de pe´diatrie, CHU Tahar Sfar, Mahdia, Tunisie h Service de pe´diatrie, CHU Hedi Chaker, Sfax, Tunisie i Service de pe´diatrie, CHU Tletli, Nabeul, Tunisie j Service de pe´diatrie, CHU Ibn Al Jazzar, Kairouan, Tunisie k Service de pe´diatrie, CHU Sahloul, Sousse, Tunisie l General Direction of Health, Ministry of Public Health, Tunis, Tunisie m Vaccines and Immunization, PATH, Seattle, E´tats-Unis b c

I N F O A R T I C L E

R E´ S U M E´

Historique de l’article : Rec¸u le 23 mars 2009 Accepte´ le 15 mai 2009 Disponible sur Internet le 5 novembre 2009

But de l’e´tude. – Le suivi e´pide´miologique des infections a` Rotavirus repose sur l’analyse mole´culaire des souches circulantes. La diversite´ ge´nomique des rotavirus du groupe A peut eˆtre analyse´e par e´lectrophore`se sur gel de polyacrylamide (PAGE) des 11 fragments d’ARN double brin ge´nomiques, ou mieux par de´termination des spe´cificite´s ge´niques VP7 et VP4, permettant ainsi une classification en ge´notypes G et P, respectivement. Le principal objectif du pre´sent travail e´tait de suivre l’e´volution des souches de RV du groupe A en circulation en Tunisie sur une pe´riode de trois ans, de 2005 a` 2007. Mate´riel et me´thodes. – L’enqueˆte a porte´ sur 1503 e´chantillons de selles provenant d’enfants de moins de cinq ans consultant ou hospitalise´s en Tunisie pour diarrhe´e entre 2005 et 2007. Les pre´le`vements positifs en Rotavirus ont e´te´ analyse´s par PAGE puis ge´notype´s par deux types de RT-PCR semi-niche´es multiplex. Re´sultats. – Le RV a e´te´ retrouve´ dans 323 e´chantillons de selles parmi 1503 (21 %). Les e´lectrophore´types longs ont pre´domine´ en Tunisie tout au long de la pe´riode d’e´tude (n = 158 versus n = 82 e´lectrophore´types courts). Le ge´notypage VP7 a permis la mise en e´vidence de cinq ge´notypes diffe´rents : G1, G2, G3, G4 et G9. Les re´sultats du typage VP4 ont montre´ une cocirculation des ge´notypes P[8], P[4], P[6] et P[11]. L’association G3P[8] e´tait pre´dominante en Tunisie en 2005 et 2006, ce´dant la place aux souches G2P[4] en 2007. ß 2009 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s.

Mots cle´s : Rotavirus Gastroente´rite E´lectrophore´type Ge´notypage VP7 VP4

A B S T R A C T

Keywords: Rotavirus Gastroenteritis Electropherotype Genotyping VP7 VP4

Background. – Rotaviruses are the most frequent agents associated with diarrhoea in children worldwide. Analysis of mobility of the 11 segments of genomic RNA by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) yields a pattern which is characteristic for a particular rotavirus isolate. The group A rotaviruses can be further characterized by analysis of VP7 and VP4 genes specificities, responsible for rotavirus classification into G and P genotypes, respectively. The aim of the present study was to determine the evolution of group A Rotavirus strains circulating in Tunisia over a 3-year period (2005–2007).

* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (A. Trabelsi). 0369-8114/$ – see front matter ß 2009 Elsevier Masson SAS. Tous droits re´serve´s. doi:10.1016/j.patbio.2009.05.007

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Material and methods. – A total of 1503 stool samples collected from children less than five years old, consulting or hospitalised in Tunisia for diarrhoea between 2005 and 2007, were screened for the presence of group A Rotaviruses. Rotavirus-positive specimens were further analyzed by PAGE and G/Pgenotyped by multiplex semi-nested RT-PCR. Results. – Rotaviruses were detected in 323 stool samples over 1503 (21 %). Long electropherotypes predominated in Tunisia during the whole period of study (N = 158 vs N = 82 short electropherotypes). VP7 genotyping showed the cocirculation of five different genotypes: G1, G2, G3, G4 and G9. VP4 typing detected four different P-genotypes: P[8], P[4], P[6] and P[11]. Rotavirus strains with G3P[8] specificity were predominating in Tunisia in 2005 and 2006, replaced by G2P[4] strains in 2007. ß 2009 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

1. Introduction Les Rotavirus (RV) constituent le principal agent e´tiologique des gastroente´rites infantiles. Le ge´nome des RV est constitue´ de 11 fragments d’ARN bicate´naire. Le caracte`re segmente´ de l’ARN viral favorise les re´assortiments et explique la variabilite´ de ces virus. L’analyse du ge´nome viral peut eˆtre re´alise´e par e´lectrophore`se sur gel de polyacrylamide (PAGE) pour caracte´riser les souches en circulation lors des e´pide´mies. La variabilite´ des de´terminants antige´niques porte´s par les prote´ines VP7 et VP4 des RV, ainsi que de celle des ge`nes qui les codent, a permis de ge´ne´rer une classification de ces virus en ge´notypes G et P. Au moins 15 ge´notypes G et 23 ge´notypes P ont pu eˆtre de´crits, re´alisant une multitude d’associations G/P [1,2]. Une technique de RT-PCR semi-niche´e multiplex, base´e sur l’amplification au moyen d’amorces spe´cifiques de type, est utilise´e pour le ge´notypage G et P. Des e´tudes re´alise´es partout dans le monde sur les souches de RV en circulation ont montre´ que les associations les plus communes dans le monde sont : G1P[8], G2P[4], G3P[8] et G4P[8] [3]. Ces e´tudes d’e´pide´miologie mole´culaire ont permis la re´alisation de progre`s conside´rables dans l’e´laboration de vaccins anti-RV. Ainsi, en 2006, deux vaccins anti-RV ont e´te´ commercialise´s : le premier est un vaccin oral, vivant pentavalent re´assortant humain-bovin (WC3) (RotaTeq, Merck) contenant les ge´notypes G1, G2, G3, G4 et P[8] ; le second est un vaccin humain vivant atte´nue´ contenant la souche RIX4414 de spe´cificite´ G1P[8] (Rotarix, Glaxo Smith Kline Biologicals). Cependant, bien que les ge´notypes G1 a` G4 soient les plus re´pandus dans le monde, certains ge´notypes tels que les ge´notypes G9, non inclus dans les vaccins, sont actuellement en e´mergence partout dans le monde [4–12]. L’e´mergence de nouveaux ge´notypes ainsi que le manque de donne´es concernant l’efficacite´ des vaccins actuels contre les souches e´mergentes incitent a` continuer la surveillance des infections a` RV avant et apre`s l’introduction des vaccins. Seule une telle surveillance permettra aux responsables nationaux de la sante´ de controˆler l’impact des programmes de vaccination sur la circulation des ge´notypes ainsi que sur l’e´mergence de souches non communes. Le principal objectif du pre´sent travail e´tait de suivre l’e´volution des souches de RV du groupe A en circulation en Tunisie sur une pe´riode de trois ans, de 2005 a` 2007. 2. Mate´riel et me´thodes 2.1. Mate´riel L’enqueˆte a porte´ sur 1503 e´chantillons de selles provenant d’enfants de moins de cinq ans consultant ou hospitalise´s en pe´diatrie ou ne´onatologie pour diarrhe´e. Il s’agit d’une e´tude prospective mene´e sur des e´chantillons collecte´s depuis le 1er janvier 2005 jusqu’au 31 de´cembre 2007. La collecte des selles a e´te´ effectue´e au niveau de huit diffe´rents CHU tunisiens, couvrant ainsi le territoire national du nord au sud. Le pre´le`vement, effectue´ a` la phase aigue¨ de la maladie, consistait a` recueillir 2 a` 3 g (ou 2 a` 3 ml) de selles dans un re´cipient ste´rile a` fermeture herme´tique. Le pre´le`vement a alors e´te´ achemine´ au laboratoire ou` il a e´te´ conserve´ jusqu’a` son

analyse a` +4 8C pendant moins de 72 heures, ou a` –20 8C pour une conservation plus longue. 2.2. Me´thodes 2.2.1. De´tection des RV du groupe A Pour la de´tection des RV dans les e´chantillons de matie`res fe´cales, on a proce´de´ a` un test immunoenzymatique (IDEIA Rotavirus, DAKO Ltd., Glostrup, Danemark) utilisant un anticorps polyclonal dirige´ contre des prote´ines spe´cifiques des RV du groupe A, notamment la prote´ine de la capside interne VP6. Il s’agit d’un test qualitatif de type Elisa sandwich pouvant eˆtre lu a` l’œil nu ou par spectrophotome´trie. 2.2.2. Extraction de l’ARN viral par le TRI-Reagent1 L’ARN viral a e´te´ extrait a` l’aide du TRI-Reagent1 (Sigma) selon la me´thode de´crite par Chomczynski et Sacchi [13]. 2.2.3. Mise en e´vidence du ge´nome viral par e´lectrophore`se sur gel de polyacrylamide (PAGE) La PAGE a utilise´ deux gels a` concentrations diffe´rentes d’acrylamide : un premier gel de re´solution a` 10 % de polyacrylamide, permettant une bonne se´paration entre les diffe´rents segments du ge´nome viral, et un second gel de concentration a` 3 % de polyacrylamide. Chaque extrait est de´pose´ sur le gel avec du bleu de migration contenant du bleu de bromophe´nol et du glyce´rol. La migration est re´alise´e dans le tampon Tris–glycine pendant 22 heures a` 100 V. La re´ve´lation a e´te´ effectue´e par coloration argentique, suite a` quoi le gel a e´te´ se´che´ entre deux feuilles de cellophane et mis dans un se´cheur de gel pendant 90 minutes. 2.2.4. Typage mole´culaire des souches de Rotavirus 2.2.4.1. De´naturation de l’ARN double brin et fixation des amorces externes sur l’ARN simple brin. A` 5 ml d’extrait d’ARNdb (environ 200 nmol) place´ dans un tube Eppendorf ont e´te´ ajoute´s 1 mM de chaque amorce sens et antisens et 3 ml d’eau DEPC. Le me´lange a e´te´ place´ dans le thermocycleur a` 97 8C pendant 5 minutes, puis imme´diatement refroidi dans de la glace [14,15]. 2.2.4.2. Transcription inverse. A` la solution ayant subi le choc thermique sont ajoute´s 40 ml d’un me´lange re´actionnel comprenant : 24 ml d’eau DEPC, 2 mM de dNTP, 5 ml du tampon de la reverse transcriptase (10 ), 2 mM de DTT (Dithiothre´itol), 4 mM de MgCl2 et 0,05 U de la Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT, Promega1). Les tubes sont alors place´s dans le thermocycleur a` 42 8C pendant 45 minutes. 2.2.4.3. Premie`re PCR. Le produit de la RT est utilise´ dans sa totalite´ en lui ajoutant : 25,7 ml d’eau distille´e ste´rile, 20 ml de tampon pour Taq polyme´rase (10 ), 0,2 mM de dNTP, 0,25 mM de MgCl2 et 1,5 U de Taq polyme´rase (Go-Taq, Promega1). L’ADNc subit une re´action de polyme´risation en chaıˆne comportant 30 cycles constitue´s chacun d’une e´tape de de´naturation pendant une minute a` 95 8C, d’une e´tape d’hybridation pendant 1 minute a` 42 8C et d’une e´longation pendant une minute a` 72 8C. Ces cycles sont pre´ce´de´s par une e´tape de de´naturation pendant cinq minutes a` 95 8C, puis suivis par une e´tape d’e´longation qui dure sept minutes a` 72 8C. 2.2.4.4. PCR semi-niche´e multiplex. Le produit de la premie`re amplification subit une seconde amplification par PCR semi-niche´e multiplex utilisant un ensemble d’amorces internes au ge`ne choisi dans les re´gions variables les mieux conserve´es dans un meˆme ge´notype, permettant l’amplification d’un fragment dont la taille est

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Tableau 1 Re´partition des ge´notypes VP7 et VP4 des souches de Rotavirus du groupe A en circulation en Tunisie entre 2005 et 2007. Nombre de souches P[4] P[6] P[8] P[11] P mixte NT* Total

G1

G2

G3

G4

G9

1 34 5 7 8

68 2 3 7 14 14

4 1 76 10 6 10

4 11 1 3 1

1 6 1

55

108

107

20

8

G mixte 0 0 8 5 2 3 18

NT*

7

7

Total 72 9 145 29 32 36 323

NT* : souches non typables.

e´taient des e´lectrophore´types longs (L1 et L2) et trois e´taient des e´lectrophore´types courts (S1, S2 et S3). Les e´lectrophore´types longs ont pre´domine´ en Tunisie tout au long de la pe´riode d’e´tude (n = 158 versus n = 82 e´lectrophore´types courts) (Fig. 1). Par ailleurs, quatre e´chantillons ont pre´sente´ un profil mixte, c’est-a`-dire contenant un nombre de bandes supe´rieur a` 11. 3.3. E´volution des ge´notypes VP7 Parmi les 323 selles positives, 316 (98 %) ont pu eˆtre type´es en VP7, soit un taux de souches non typables de 8 %. Le ge´notypage VP7 a permis la mise en e´vidence de cinq ge´notypes diffe´rents : G1, G2, G3, G4 et G9 (Tableau 1). Une grande he´te´roge´ne´ite´ dans la distribution des ge´notypes VP7 a pu eˆtre mise en e´vidence. En 2005 et 2006, les souches de ge´notype G3 e´taient pre´dominantes puis en 2007, c’est le ge´notype G2 qui a pre´domine´ (Fig. 2). Fig. 1. E´lectrophore´types (apre`s e´lectrophore`se sur gel de polyacrylamide a` 10 % et coloration argentique) des ARN ge´nomiques des souches de Rotavirus en circulation en Tunisie entre 2005 et 2007. Deux profils longs (L1 et L2) et trois profils courts (S1, S2 et S3) diffe´rents sont pre´sente´s coˆte a` coˆte, de la gauche vers la droite.

spe´cifique du ge´notype [14,15,16]. La quantite´ d’ADN utilise´e dans cette e´tape de´pend de l’intensite´ de la bande apre`s la premie`re amplification : elle varie ainsi entre 0,5 ml, lorsque la bande est intense, et 6 ml, en cas d’absence de bande. A` cette quantite´ sont ajoute´s 0,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP, 0,2 mM de chaque amorce, 10 ml de tampon PCR 10 , 1,5 U de Taq polyme´rase et un volume d’eau ste´rile suffisant pour obtenir un volume final de 50 ml. La mixture doit eˆtre pre´pare´e dans de la glace, puis place´e dans le thermocycleur pour une seconde amplification selon le meˆme protocole que celui utilise´ pre´ce´demment. 2.2.4.5. Re´ve´lation des produits de la PCR. Les produits d’amplification ainsi qu’un marqueur de poids mole´culaire (100 bp ladder ; Promega1) ont subi une e´lectrophore`se sur gel d’agarose a` 2 % contenant 0,0015 % de bromure d’e´thidium (BET) dans un tampon de migration Tris–Borate–EDTA (TBE). La visualisation des bandes d’ADN est faite sous lumie`re ultraviolette.

3. Re´sultats 3.1. Taux de de´tection des RV

3.4. E´volution des ge´notypes VP4 Parmi les 323 selles positives, 287 (89 %) ont pu eˆtre type´es en VP4. Le ge´notypage VP4 a permis la mise en e´vidence de quatre ge´notypes diffe´rents : P[4], P[6], P[8] et P[11], ainsi que de ge´notypes mixtes (Tableau 1) avec des taux de de´tection variables d’une anne´e a` l’autre : le ge´notype pre´dominant e´tait le ge´notype P[8] entre 2005 et 2006, laissant la place au ge´notype P[4] en 2007 (Fig. 3). 3.5. Associations VP7/VP4 Au total, 286 (89 %) selles ont pu eˆtre ge´notype´es simultane´ment en VP7 et VP4, permettant ainsi la mise en e´vidence de 17 types d’associations distinctes (Tableau 1) ainsi qu’un taux conside´rable d’associations mixtes (50 souches, soit 17 % des souches G/P-typables). L’association G3P[8], pre´dominante en Tunisie, en 2005 et 2006, a ce´de´ la place aux souches G2P[4] en 2007. Il e´tait inte´ressant de noter que des associations inhabituelles ont pu eˆtre mises en e´vidence : G2P[8] et G3P[4].

Le RV a e´te´ retrouve´ dans 323 e´chantillons de selles parmi 1503 (21 %). La re´partition des e´chantillons positifs selon les anne´es e´tait comme suit : 69 selles positives sur 324 en 2005 (21,3 %) ; 106 selles positives sur 614 en 2006 (17,4 %) ; 148 selles positives sur 565 en 2007 (26,2 %). 3.2. E´volution des e´lectrophore´types de Rotavirus du groupe A entre 2005 et 2007 en Tunisie Sur les 323 selles positives en Elisa, 244 (75,5 %) ont e´te´ positives en PAGE. Au total, cinq profils e´lectrophore´tiques diffe´rents ont cocircule´ pendant la pe´riode d’e´tude, dont deux

Fig. 2. E´volution des ge´notypes VP7 des souches de Rotavirus du groupe A en Tunisie entre 2005 et 2007.

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Fig. 3. E´volution des ge´notypes VP4 des souches de Rotavirus du groupe A entre 2005 et 2007 en Tunisie.

4. Discussion 4.1. E´lectrophore`se sur gel de polyacrylamide La cocirculation de nombreux profils e´lectrophore´tiques, avec pre´dominance de l’un d’entre eux, a de´ja` e´te´ mise en e´vidence par de nombreux auteurs et elle est d’ailleurs conside´re´e comme caracte´ristique de l’e´pide´miologie des infections a` RV [17]. Par ailleurs, quatre e´chantillons ont pre´sente´ un profil mixte, c’est-a`dire contenant un nombre de bandes supe´rieur a` 11. Ces profils mixtes ont pre´ce´demment e´te´ rapporte´s dans plusieurs e´tudes [18,19]. Particulie`rement fre´quents en pe´riode d’e´pide´mie, ces profils te´moignent d’infections mixtes chez un meˆme enfant et peuvent re´sulter en la survenue de re´assortiments. 4.2. E´volution des ge´notypes VP7 en circulation La pre´sente e´tude a permis de mettre en e´vidence une e´volution tre`s dynamique des ge´notypes G de RV au cours des anne´es. En 2005, le ge´notype G3 est devenu le ge´notype pre´dominant en Tunisie aux de´pens du ge´notype G1, jusque-la` largement majoritaire depuis 1995 [20]. Le ge´notype G3, absent en Tunisie entre 1995 et 1999, avait initialement e´te´ de´tecte´ entre 2000 et 2004 sous forme de quelques cas sporadiques [20]. En 2007, on a assiste´ a` une nette augmentation des souches de ge´notype G2, ce ge´notype e´tant devenu le ge´notype le plus fre´quemment isole´ en Tunisie (52 % des cas). Le ge´notype G2 a e´te´ rapporte´ entre 1996 et 1998 en Argentine [18] et en Inde [21] avec des pre´valences de 43 % et 22 %, respectivement. Durant la pe´riode 2006–2007, le ge´notype G4, rarement de´tecte´ en Tunisie entre 1995 et 2004 [20], a e´galement commence´ a` s’e´tendre, avec des taux de de´tection de 7 % et 9 % en 2006 et 2007, respectivement. Les ge´notypes (G2, G3 et G4) font partie des ge´notypes les plus re´pandus partout dans le monde, apre`s le ge´notype G1 et circulent selon des proportions variables d’une re´gion a` une autre et d’une pe´riode a` l’autre [4–12]. En 2004, des souches de ge´notype G9 ont e´te´ isole´es pour la premie`re fois en Tunisie [20]. Leur de´tection s’est poursuivie en Tunisie dans la pe´riode 2005–2007. La mise en e´vidence des souches G9 de RV du groupe A avait auparavant e´te´ rapporte´e dans plusieurs e´tudes africaines [6,11,22]. Ce ge´notype G9 a e´te´ de´crit jusqu’ici essentiellement dans les infections humaines et plus rarement dans les infections animales [23].

tunisienne, puisque ce ge´notype e´tait e´galement pre´dominant en Tunisie entre 1995 et 2004 [20]. Toutefois, en 2007, on a vu la pre´dominance du type P[4] (39 % de P[4] versus 22 % de P[8]), celui-ci ayant e´te´ de´tecte´ selon un taux tre`s faible durant les anne´es pre´ce´dentes. D’apre`s les donne´es de la litte´rature, le ge´notype P[8] constitue le type VP4 pre´dominant au niveau mondial : au Japon (97,4 %) [24], en Tanzanie (83,7 %) [25], en Inde (31 %) [21], au Bre´sil (98,9 %) [19] et en Irlande (78 %) [26]. En revanche, d’apre`s une e´tude re´alise´e en Argentine [18], le ge´notype P[4] e´tait le type pre´dominant (71 %). Durant la pe´riode 2006–2007, on a constate´ l’e´mergence en Tunisie d’un nouveau ge´notype VP4 : le ge´notype P[11] (8 % et 16 % des cas en 2006 et 2007, respectivement). Ne´anmoins, un se´quenc¸age de ces souches reste indispensable afin de confirmer ce re´sultat pre´liminaire. Le ge´notype P[11] est actuellement en e´mergence dans certaines re´gions du monde : deux e´tudes indiennes ont retrouve´ ce ge´notype avec des taux de de´tection de 3 % et 8,5 % [21,27] et il a e´te´ de´crit en Indone´sie avec une pre´valence de 0,5 % [28]. 4.4. Association des ge´notypes VP7/VP4 L’association G1P[8] e´tait pre´dominante en Tunisie entre 1995 et 2004 [20] ; cette association fait partie des associations les plus communes partout dans le monde. En 2005 et 2006, G1P[8] a ce´de´ la place aux associations G3P[8], puis aux souches G2P[4] en 2007. Il s’agissait dans tous ces cas de combinaisons stables faisant intervenir des ge´notypes avec affinite´s puissantes les uns envers les autres : en effet, d’apre`s les donne´es de la litte´rature [29,30], le ge´notype P[4] est commune´ment lie´ au ge´notype G2, alors que le ge´notype P[8] est souvent associe´ aux ge´notypes G1, G3 et G4. Pourtant, nous avons pu mettre en e´vidence la circulation de souches de RV pre´sentant des associations VP7/VP4 non communes, telles que G2P[8] et G3P[4]. L’existence de telles associations a pre´ce´demment e´te´ rapporte´e dans d’autres travaux : elle te´moigne de la grande variabilite´ des RV et de l’e´ventualite´ de re´assortiments au sein des souches [3,31]. Peu de donne´es concernant le ge´notype P[11] sont disponibles dans la litte´rature. Une e´tude re´alise´e en Inde, ou` le ge´notype P[11] correspond a` un des ge´notypes VP7 majoritaires, a montre´ que les ge´notypes P[11] e´taient toujours associe´s aux ge´notypes G10. Dans la pre´sente e´tude, au niveau de laquelle les ge´notypes G10 n’ont pas e´te´ recherche´s, les souches de ge´notype P[11] ont e´te´ retrouve´es en association aussi bien avec les ge´notypes G1 a` G4 qu’avec les ge´notypes G9 [21,27]. Dans la pre´sente e´tude, les souches G9 ont e´te´ retrouve´es en association avec les ge´notypes VP4 P[8], P[6] et P[11]. D’apre`s les donne´es de litte´rature, elles ont de´ja` e´te´ rapporte´es en association avec ces diffe´rents ge´notypes VP4, ainsi qu’avec les ge´notypes P[4] et P[19], mais l’association la plus fre´quemment retrouve´e reste celle avec les ge´notypes P[8] [32–35]. La proportion des infections mixtes dans le pre´sent travail e´tait conside´rable (17 %). Ce re´sultat est ne´anmoins similaire a` celui rapporte´ dans plusieurs e´tudes re´alise´es dans des pays en de´veloppement, notamment au Bre´sil (29 %) [36], en Inde (21 %) [21] et au Bangladesh (17 %) [37]. La grande fre´quence des infections mixtes favorise l’e´mergence continue de nouvelles souches. 5. Conclusion

4.3. E´volution des ge´notypes VP4 en circulation En 2005, les ge´notypes P[4], P[6] et P[8] ont cocircule´ en Tunisie. Ces trois ge´notypes sont les ge´notypes VP4 les plus souvent isole´s au niveau mondial. La pre´dominance du ge´notype P[8] observe´e en 2005–2006 a confirme´ les re´sultats de la pre´ce´dente e´tude

Il semblerait que la diversite´ ge´ne´tique des souches en circulation dans les pays en de´veloppement soit particulie`rement e´leve´e : la cohabitation entre Homme et be´tail, fre´quente dans ces pays, favoriserait l’apparition et la pe´rennite´ de nouvelles souches non communes [21,37]. L’e´mergence des souches G9P[8] en

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Tunisie confirme que de telles souches sont en cours d’extension au niveau mondial ou` elles sont signale´es de plus en plus fre´quemment. Bien que les souches G9P[8] ne sont pas incluses dans les vaccins actuellement commercialise´s, la pre´sence du ge´notype P[8] pourrait expliquer l’immunite´ he´te´rotypique observe´e dans les essais cliniques re´alise´s [38–41]. Cependant, la re´ponse immunitaire spe´cifique de ge´notype semble assurer une meilleure protection que la re´ponse he´te´rologue et la vigilance reste donc de rigueur : il semble primordial de continuer a` analyser le changement des souches identifie´es d’une anne´e a` l’autre, afin notamment de de´tecter d’e´ventuelles souches e´mergentes avant et apre`s l’introduction du vaccin dans un pays [39,42,43]. 6. Conflits d’inte´reˆts Les auteurs de´clarent n’avoir aucun conflit d’inte´reˆt. Remerciements Le pre´sent travail a e´te´ finance´ graˆce au don V27/181/167 de l’OMS, EMRO. Re´fe´rences [1] Estes MK. Rotaviruses and their replication. In: Fields, Knipe DM, Howley PM, Chanock RM, et al., editors. Fields virology. 4th ed., Philadelphia: LippincottRaven Press; 1996. p. 1747–85. [2] Rahman M, Matthijnssens J, Goegebuer T, De Leener K, Vanderwegen L, Van der Donck I, et al. Predominance of rotavirus G9 genotype in children hospitalized for rotavirus gastroenteritis in Belgium during 1999–2003. J Clin Virol 2005;33:1–6. [3] Gentsch JR, Woods PA, Ramachandran M, Das BK, Leite JP, Alfieri A, et al. Review of G and P typing results from a global collection of rotavirus strains: implication for vaccine development. J Infect Dis 1996;174:S30–6. [4] Iturriza-Gomara M, Cubitt D, Steele AD, Green J, Brown D, Kang G, et al. Characterisation of rotavirus G9 strains isolated in the UK between 1995 and 1998. J Med Virol 2000;61:510–7. [5] Cunliffe NA, Dove W, Bunn JEG, Ben Ramadam M, Nyangao JW, Riveron RL, et al. Expanding global distribution of rotavirus serotype G9: Detection in Libya. Emerg Infect Dis 2001;7:890–2. [6] Steele AD, Nimzing L, Peenze I, De Beer MC, Geyer A, Angyo I, et al. Circulation of the novel G9 and G8 rotavirus strains in Nigeria in 1998/1999. J Med Virol 2002;67:608–12. [7] Kirkwood C, Bogdanovic-Sakran N, Palombo E, Masendycz P, Bugg H, Barnes G, et al. Genetic and antigenic characterization of rotavirus serotype G9 strains isolated in Australia between 1997 and 2001. J Clin Microbiol 2003;41:3649– 54. [8] Laird AR, Gentsch JR, Nakagomi T, Nakagomi O, Glass RI. Characterization of serotype G9 rotavirus strains isolated in the United States and India from 1993 to 2001. J Clin Microbiol 2003;41:3100–11. [9] Martella V, Terio V, Del Gaudio G, Gentile M, Fiorente P, Barbuti S, et al. Detection of the emerging rotavirus G9 serotype at high frequency in Italy. J Clin Microbiol 2003;41:3960–3. [10] Santos N, Volotao EM, Soares CC, Albuquerque MC, da Silva FM, Chizhikov V, et al. VP7 gene polymorphism of serotype rotavirus strains and its impact on G genotype determination by PCR. Virus Res 2003;93:127–38. [11] Steele AD, Ivanoff B. Rotavirus circulating in Africa during 1996–1999: Emergence of G9 strains and P[6] strains. Vaccine 2003;21:361–7. [12] Heaton PM, Goveia MG, Miller JM, Offit P, Clark HF. Development of a pentavalent rotavirus vaccine against prevalent serotypes of rotavirus gastroenteritis. J Infect Dis 2005;192:17–21. [13] Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thyocianate–phenol–chloroform extraction. Anal Biochem 1987; 162:156–9. [14] Gouvea V, Glass RI, Woods P, Taniguchi K, Clark HF, Forrester B, et al. Polymerase chain reaction amplification for typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens. J Clin Microbiol 1990;28:276–82. [15] Gentsch JR, Glass RI, Woods P, Gouvea V, Gorziglia M, Flores J, et al. Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1992;30:1365–73. [16] Iturriza-Gomara M, Green J, Brown DWG, Desselberger U, Gray JJ. Diversity within the VP4 gene of rotavirus P[8] strains: Implications for reverse transcription-PCR genotyping. J Clin Microbiol 2000;38:898–901. [17] Steele AD, Mnisi YN, Williams MM, Bos P, Aspinall S. Electrophoretic typing of nosocomial rotavirus infection in a general paediatric unit showing the continual introduction of community strains. J Med Virol 1993;40:126–32.

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